TraC通过招募宿主C4b结合蛋白来帮助猪霍乱沙门氏菌逃避补体系统的攻击

《Microbial Pathogenesis》：TraC promotes complement evasion of Salmonella enterica serovar Choleraesuis by recruiting host C4b-binding protein

　　

庄伟林|潘鹏|张红艳|陈开锋|关金|于思琪|范海林|徐成刚|廖明|张建民

中国广东省广州市510642，华南农业大学兽医学院，人畜共患病药物国家区域联合工程实验室

摘要

猪霍乱沙门氏菌是一种具有高度侵袭性的动物源病原体，能引发严重的全身性感染。补体系统是抵御循环细菌的重要先天防御机制。然而，猪霍乱沙门氏菌对补体介导的杀伤作用具有抵抗力的分子机制至今仍不清晰。本研究通过对具有不同血清抗性表型的猪霍乱沙门氏菌分离株进行全基因组测序和泛基因组比较分析，发现了5个与增强血清中存活能力相关的候选基因，其中traC是被认为最关键的基因。在猪霍乱沙门氏菌中，删除traC后，其血清抗性降低了73%，对HeLa细胞的黏附和侵入能力分别下降了55%和71%，在RAW264.7细胞中的存活时间也减少了24–55%。在小鼠感染模型中，缺失traC显著降低了细菌在体内的扩散程度，血液、肝脏和脾脏中的细菌载量分别减少了80%、32%和63%。通过基因互补实验，traC的功能可恢复到接近野生型水平。从机制上来看，TraC能够促进宿主补体调节蛋白C4b结合蛋白的招募，这可能有助于因子I介导的C3b降解，从而减少细菌表面的C3b沉积，提高细菌在血清环境中的存活率。共免疫沉淀和GST拉取实验进一步证实了TraC与C4BP之间存在相互作用，这一作用可能涉及TraC的N端区域。此外，在侵袭性较低的猪霍乱沙门氏菌中过表达traC也能提升其血清抗性并抑制补体沉积。综上所述，这些研究结果表明TraC在猪霍乱沙门氏菌的补体逃逸过程中起重要作用，可通过调控宿主补体系统来帮助细菌在血液感染中适应环境。

引言

沙门氏菌是全球范围内重要的动物源病原体，也是导致食物源性细菌性疾病的主要致病菌之一[1]。它每年都会给公共卫生带来巨大负担，导致全球范围内数百万例临床感染和大量死亡病例[2]。该菌主要通过食用受污染的食物，尤其是禽肉、猪肉、鸡蛋和乳制品，或是直接接触受感染的动物或污染环境而传播[3]。虽然大多数感染仅局限于肠道并会自行消退，但有一部分病例会发展为侵袭性非伤寒沙门氏菌病，包括菌血症、败血症和脑膜炎，尤其是在免疫功能低下的人群以及中低收入地区更为常见[4]。在已发现的2600多种血清型中，猪霍乱沙门氏菌以其高度的侵袭性和易于在血液中扩散的特性而著称，常常引发严重的全身性疾病并导致高死亡率[5]。尽管该菌具有重要的临床意义且日益引起公共卫生关注，但其能够在血液中建立系统性感染的分子机制仍未完全明确。

补体系统是先天免疫的重要组成部分，在识别和清除入侵的病原体，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等方面起着关键作用[6]。补体系统可通过经典途径、凝集素途径和替代途径被激活，这些途径最终都会作用于补体成分C3，进而导致C3沉积、抗原标记，最终清除病原体[7]。能否抵抗补体介导的杀伤作用，直接影响病原体是否能在血液中存活和扩散，从而影响侵袭性感染的形成[8]。越来越多的证据表明，招募宿主的补体调节蛋白是一种在多种微生物病原体中普遍存在的免疫逃逸策略。例如，牛痘病毒、白色念珠菌和烟曲霉等真菌病原体，以及恶性疟原虫和克鲁兹锥虫等寄生虫，都被发现能与宿主的补体调节因子如因子H和C4b结合蛋白相互作用，从而减弱补体激活并逃避免疫清除[[9], [10], [11], [12], [13]]。在这些补体调节因子中，C4b结合蛋白是经典途径和凝集素途径的主要可溶性抑制剂。它作为因子I介导的C3b和C4b切割反应的辅因子，能够有效限制补体的放大作用和表面抗原标记。一些细菌病原体已经进化出将C4BP招募到表面的机制作为免疫逃逸手段。这些发现提示猪霍乱沙门氏菌也可能利用宿主的补体调节因子来帮助其在血液中存活并引发侵袭性感染。

基于这一假设，本研究对具有不同血清抗性表型的猪霍乱沙门氏菌菌株进行了全基因组和泛基因组比较分析。这些分析结果显示TraC是与血清抗性和侵袭性最相关的候选基因。随后，我们进一步系统研究了TraC在补体调节、宿主细胞相互作用以及全身性感染中的作用，旨在阐明TraC介导的补体逃逸机制。

章节要点

细菌菌株、质粒、细胞、引物及实验动物

本研究中使用的猪霍乱沙门氏菌菌株、HeLa人宫颈癌细胞以及RAW264.7小鼠巨噬细胞均保存在华南农业大学动物传染病实验室。常用的实验室载体为质粒pKD4、pKD46、pCP20和pBAD-HisA，而大肠杆菌DH5α和BL21菌株则分别用于分子克隆和蛋白质表达。引物是根据相应基因组的序列设计的

鉴定与猪霍乱沙门氏菌血清抗性相关的关键基因

通过血清抗性试验和HeLa细胞侵入试验，对21株猪霍乱沙门氏菌分离株进行了表型分析（见图1A–B）。其中13株临床分离株表现出较强的血清抗性（在小鼠血清中的存活倍数大于5），且侵袭能力较强（细菌计数大于1×10⁷ CFU/mL），而另外8株分离株的血清抗性较弱（在小鼠血清中的存活倍数小于3），侵袭能力也较低（细菌计数小于1×10⁷ CFU/mL）。随后，这些分离株被用于全基因组测序

讨论

尽管猪霍乱沙门氏菌被广泛认为是最具侵袭性的沙门氏菌血清型之一[29]，但其能够有效突破血液中的免疫屏障并引发全身性感染的分子机制仍不明确。为填补这一研究空白，我们将表型特征分析与全基因组和泛基因组比较分析相结合，系统地比较了那些具有强血清抗性和高侵袭性的临床分离株与其他菌株之间的差异

结论

通过综合表型分析和全基因组分析，本研究确定TraC是与猪霍乱沙门氏菌的血清抗性和侵袭性相关的因素。功能研究和机制分析表明，TraC能够招募宿主的补体调节蛋白C4BP，这一过程有助于减少细菌表面的C3b沉积，并调节依赖Ca²⁺的补体激活途径，从而提高细菌在血液中的存活率。此外，在

伦理声明

本研究已获得华南农业大学伦理委员会的批准（批准编号：2024f245）。

CRediT作者贡献说明

庄伟林：概念设计、正式分析、研究实施、方法学设计、结果可视化、初稿撰写。潘鹏：正式分析、研究实施、方法学设计。张红艳：研究实施、方法学设计。陈开锋：方法学设计、论文审阅与编辑。关金：研究实施。于思琪：结果验证。范海林：结果可视化。徐成刚：实验资源提供、结果验证。廖明：概念设计、论文审阅与编辑。张建民：概念设计、资金筹集

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了以下项目的资助：中国国家自然科学基金（编号：32273007）；中国国家肉鸡产业技术体系项目（编号：CARS-41）；中国农业科学院高层次科技创新战略专项基金（编号：R2021PY-QY006）；中国“双一流”学科建设推进项目（编号：2023B10564003）。