在具有生物相关性的金属盐存在下设计咪唑封端的层粘连蛋白衍生肽水凝胶，以此制备用于调控细胞行为的先进生物功能支架

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Designing imidazole capped laminin inspired peptide hydrogels in the presence of biologically relevant metal salts to fabricate advanced biofunctional scaffold for controlling cellular behaviour

　　

Rakesh Kumar|Pooja Sharma|Sweta Mohanty|Sangita Roy

印度旁遮普邦莫哈利知识城第81区，纳米科学和技术研究所，邮编140306

摘要

从细胞外基质蛋白中获得的自组装肽因其生物相容性和可降解性，为组织工程提供了良好的平台。短寡肽能够自组装成具有纳米纤维结构的超分子水凝胶，这类结构有助于细胞的黏附与增殖。在此，我们设计了一种新型的层粘连蛋白衍生肽——咪唑-苯丙氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（Imi-FSIKVAV），该肽在生理pH值下能够自组装成纳米纤维，以此提升水凝胶的亲水性和生物相容性。咪唑作为组氨酸等生物分子中的常见结构单元，可为金属离子提供结合位点。研究表明，添加钙离子或镁离子等生物活性金属离子能显著提高该肽的自组装能力，进而形成结构紧密的纳米水凝胶。这类金属离子协调的水凝胶具有更优异的机械性能，同时也能促进神经母细胞嘅黏附与增殖。通过利用肽与金属离子之间的独特相互作用，我们可以创造出不仅能模拟天然细胞外基质的结构特性，还能促进细胞功能、助力组织修复与再生的先进材料。我们的研究凸显了金属离子介导的肽自组装作为一种策略，在设计适用于多种生物医学应用的创新生物材料方面的潜力，为组织工程和再生疗法的未来发展奠定了基础。

引言

近二十年来，自组装技术因能为纳米技术开辟新方向、帮助制造出能够模拟天然生物材料且适应生物相关微环境的先进材料而备受关注。短寡肽可通过“自下而上”的方式自组装，使单体形成纳米管、纳米纤维、囊泡等各类超分子纳米结构。这类自组装肽因其天然来源、生物相容性和可降解性而具有诸多优势。因此，基于肽的纳米结构有望被用于开发先进的生物分子支架，以模拟细胞外基质的复杂结构完整性。已有不少研究致力于设计能够有效模拟细胞外基质结构的蛋白质和肽基自组装水凝胶系统。在相关研究中，从层粘连蛋白中提取的IKVAV和YIGSR这两种五肽已被证实，当它们被整合到聚合物基质中或与两亲性链、肽间隔序列或其他功能性衍生物共价结合时，具备模拟细胞外基质关键功能的能力。这些层粘连蛋白衍生肽不仅能促进细胞黏附，还能与胶原蛋白、肌动蛋白、整联蛋白等细胞外基质的其它成分结合。在层粘连蛋白中，IKVAV是促使神经前体细胞分化为神经元的主要生物活性序列。但由于其疏水性较强，并非总能让所有类型的神经细胞顺利附着在所设计的基质上，这就为对这一肽序列进行结构改造提供了可能，这样的改造既能提升IKVAV序列的亲水性，又能增强其在水溶液中的自组装能力。我们有理由推测，亲水性的提升会提高肽的溶解度，进而增强肽之间的相互作用，形成更为复杂的纳米纤维网络，从而更好地促进细胞黏附。已有不少研究致力于调控这一肽序列，以改善细胞的反应表现。Horgan等人证明，Fmoc-DIKVAV与Fmoc-FRGDF共同作用可促使C2C12细胞形成肌管。Zou等人发现，将IKVAV经过EKEKEK修饰后形成两性离子肽，其作为植入式神经探针时的抗污性能得到了提升。Hosseinkhani等人表明，当将胶原蛋白与IKVAV结合时，所得支架更有利于神经突的生长与延伸。此外，Farrukh等人发现，聚赖氨酸能与IKVAV协同作用，促进神经发生。在我们之前的研究中，Jain等人设计了由Nap-IKVAV与胶原蛋白结合而成的生物活性支架，用以调控细胞行为。为了形成超分子凝胶，他们还在IKVAV肽的N端加入了长烷基链、芳香基团或短疏水基团。显微分析结果显示，降低肽的疏水性会使组装结构从Fmoc-和肉豆蔻酰-IKVAV情况下的短纳米纤维，转变为乙酰化IKVAV情况下结构更为规整的长纳米纤维。这一发现极具意义，它让我们深入了解了序列整体疏水性在控制其在水环境中的自组装行为中所起的关键作用。沿着类似的研究方向，Jain等人还研究了Fmoc-IKVAV和Fmoc-YIGSR这类层粘连蛋白衍生序列，旨在制备具有特定结构和功能属性、可用于组织工程的水凝胶支架。由于疏水性更强，Fmoc-IKVAV的最小凝胶化浓度为15 mM，而亲水性更高的Fmoc-YIGSR则为10 mM。值得注意的是，Fmoc-YIGSR形成的长纤维网络比Fmoc-IKVAV形成的短纤维更能有效促进神经元增殖。基于这些研究成果，我们目前的课题着重研究经过最小程度修饰的Fmoc-IKVAV肽的疏水性和生物活性，旨在开发出一类具有更强生物功能、全新的自组装层粘连蛋白衍生支架。受这些研究的启发，我们采用了两步策略，既要提升IKVAV肽的亲水性，也要增强其自组装能力，进而提高其支持细胞功能的生物活性。具体而言，我们首先在肽的N端引入咪唑作为保护基团，随后再加入苯丙氨酸和丝氨酸残基。相比Fmoc或Boc这类传统保护基团，咪唑具有更高的极性和更好的生物相容性，它天然存在于组氨酸、组胺、生长素等生物系统中，同时还具备多种药理活性，包括抗癌、抗病毒、抗炎和降糖作用。更重要的是，咪唑的多个结合位点使其能够通过非共价相互作用或与无机离子、生物分子的配位实现超分子组装。此外，研究表明加入苯丙氨酸能增强自组装能力，而丝氨酸则能提升亲水性，从而使肽具备平衡的两亲性特征。以往的研究指出，二苯丙氨酸是推动自组装的经典因子，而丝氨酸则有助于促进细胞的黏附与增殖。基于这些认识，我们设计了Imi-FSIKVAV肽，期望它能克服早期IKVAV衍生物的疏水性局限，成为用于先进组织工程应用的高效水凝胶体系。除此之外，近期还有研究指出，金属离子的存在也是一种能够诱导肽基自组装的独特方法。已有不少自组装凝胶系统的案例表明，金属离子的配位在促进和稳定自组装过程中起着关键作用。Schneider及其团队就曾利用锌盐促使β-发夹肽发生凝胶化。锌离子、汞离子、镉离子和铅离子也被用于诱导肽的自组装。Stupp的研究小组还发现了另一种由钙离子触发肽两亲体凝胶化的独特案例。在我们之前的实验中，不同金属离子对基于组氨酸的二肽两亲体的自组装过程有着显著影响。由于铜离子、镍离子和钴离子与组氨酸之间存在较强的相互作用，因此在pH值为7时，体系的状态会从凝胶态转变为溶胶态。然而对于铁离子和锰离子而言，尽管根据Irving William系列理论，组氨酸与这些金属离子之间的相互作用较弱，但体系的凝胶强度仍会大幅下降。受这些案例的启发，我们引入了钙离子和镁离子来诱导肽的自组装。钙离子和镁离子能够与自组装形成的肽纳米纤维发生交联，进而形成水凝胶。因此，了解肽与金属离子之间的相互作用，是开发受生物系统启发的功能性材料的重要途径。

基于以上思路，我们设计了一种新型的、带有咪唑封端且相对亲水的层粘连蛋白衍生肽序列，该序列在生理pH值下即可形成水凝胶。此外，我们还研究了咪唑基团的离子配位能力，希望在含有生理浓度下的钙离子和镁离子环境下，能够制备出多种纳米级的不同水凝胶，这类水凝胶有望应用于生物医学领域。这种新设计的七肽序列（咪唑-苯丙氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸）在生理pH值下就能自组装，形成长的纳米纤维结构。而在自组装体系中加入钙离子和镁离子后，所得纳米结构的密度显著提升。与仅在生理pH值下形成的肽水凝胶相比，含有钙离子和镁离子配位的肽水凝胶的存储模量有了明显上升，因此能够基于相同的分子结构构建出具有不同物理特性的多种支架。这类具有可调物理性质的金属配位肽水凝胶，还能进一步促进神经母细胞的黏附与增殖。由此可见，这些新开发的金属配位仿生支架能够突破传统控制肽的局限性，为打造更优质的生物医学用材料带来新的可能性。

章节节选

金属离子存在下咪唑封端肽序列的合成与表征

从之前的研究结果可以看出，Fmoc-IKVAV是一种疏水性肽，其clogP值约为4.5，这一数值也证实了它的疏水特性。由于疏水性较强，Fmoc-IKVAV在水中的溶解度较低，这不仅影响了它在水溶液中的自组装行为，也使得它的最小凝胶化浓度高达15 mM。此外，由于溶解度有限，它在水中容易形成较短的纤维，而这些短纤维会妨碍细胞的黏附与存活。

结论

综上所述，我们设计了一种层粘连蛋白衍生的肽水凝胶，成功解决了之前研究中的诸多局限性。这种新设计的Imi-FSIKVAV肽具有良好的疏水性、亲水性和芳香性平衡，其最小凝胶化浓度明显低于Fmoc-IKVAV。除此之外，它的形态和机械性能也发生了显著变化。我们进一步研究了这种层粘连蛋白衍生肽的自组装特性。

CRediT作者贡献说明

Rakesh Kumar：撰写原始稿件、方法部分、实验研究、正式分析、数据整理。Pooja Sharma：方法部分、实验研究、正式分析、数据整理。Sweta Mohanty：撰写原始稿件、方法部分、实验研究。Sangita Roy：撰写审稿与编辑内容、项目监督、项目管理、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢DST-SERB项目（编号SPG/2020/000748）以及CSIR-ASPIRE项目（编号01WS (021)/2023-24/EMRII/ASPIRE）提供的资金支持。R.K.感谢莫哈利纳米科学和技术研究所给予的博士奖学金。S.M.感谢UGC-SJSGC提供的博士奖学金。P.S.感谢DST inspire项目提供的奖学金。作者们还要感谢莫哈利纳米科学和技术研究所提供的基础设施支持。