砷（As)与镉（Cd)联合硒（Se)对金鱼氧化应激指标的共同影响：对兽医学毒理学的意义

《Veterinary Medicine and Science》：Combined Effects of Arsenic and Cadmium With Selenium on Oxidative Stress Indicators in Goldfish: Implications for Veterinary Toxicology

　　

背景：包括砷（As)和镉（Cd)在内的有毒重金属及其与硒（Se)的相互作用，在调节水生生物的生物累积模式和氧化应激反应中发挥着关键作用。
目的：本研究旨在评估As、Cd和Se单独及联合暴露对金鱼（Carassius auratus)组织金属累积和氧化应激生物标志物的影响。
方法：将210尾鱼随机分配至7个实验组，每组设3个重复，通过水体暴露于As、Cd和Se的单剂或联合浓度，持续14天。暴露期结束后，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)测定组织中金属浓度。采用分光光度法和商业检测试剂盒评估包括丙二醛（MDA)、过氧化氢酶（CAT)和超氧化物歧化酶（SOD)在内的氧化应激生物标志物。
结果与结论：与初始值相比，所有处理组的体重均有所增加。Se共同暴露显著降低了As的累积，组织浓度从As组的0.16 ± 0.02 mg/kg降至联合暴露组的0.10 ± 0.009 mg/kg（约降低62%；p < 0.05)。相反，Cd组（1.06 ± 0.09 mg/kg)与Cd+Se组（1.01 ± 0.07 mg/kg)之间的Cd累积无显著差异（p > 0.05)。在所有组（包括对照组）中均观察到As浓度与MDA水平之间存在显著正相关（p < 0.01)。反之，Se与MDA呈负相关，与SOD呈正相关，表明其对氧化损伤具有保护作用。总体而言，研究结果表明重金属联合暴露可产生从拮抗到潜在协同效应不等的可变毒理学相互作用，具体取决于金属类型和暴露条件。这些相互作用与氧化应激反应密切相关，突显了对水生生物的潜在生态风险以及与食用受污染鱼类相关的公共卫生问题。

工业活动的快速发展导致重金属广泛释放至水生和陆地生态系统，造成显著环境污染、食品安全性降低以及生物体的急慢性毒性效应。重金属具有高持久性、不可生物降解性以及对生物大分子的强亲和力，易通过食物链进入动植物组织，最终经由受污染的水、食物和空气进入人体。慢性暴露于这些金属与致癌性、神经毒性、内分泌干扰和细胞水平氧化损伤等不良健康后果相关。砷（As）、镉（Cd）、汞（Hg）和铅（Pb）等元素即使在低浓度下也呈现高毒性。Cd暴露主要经由食物摄入、香烟烟雾和工业排放，具有长生物半衰期，在肝脏和肾脏等重要器官累积，导致肾功能障碍、骨骼损伤和癌症风险增加。As暴露主要通过受污染饮用水和农产品，急性病例表现为胃肠道紊乱，慢性暴露条件下则与皮肤病变、心血管疾病和各类癌症相关。与之相对，硒（Se）是抗氧化防御、免疫功能和甲状腺激素代谢所必需的微量元素，但其营养需求与毒性之间的阈限狭窄，使得缺乏与过量均具有临床相关性。许多重金属尤其是Cd和As的共同毒性机制是通过产生活性氧（ROS）诱导氧化应激，导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤。氧化应激生物标志物如丙二醛（MDA）以及抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等被广泛用于评估细胞氧化还原失衡。鱼类因其直接接触水体污染物，被广泛接受为水污染的敏感生物指示物。金鱼（Carassius auratus）因其生理敏感性、易于饲养以及生化反应特征明确等特点，被广泛用作毒理学和环境生物学研究的模式生物。尽管已有研究探讨了单一金属的毒性，但对于As、Cd和Se联合暴露的交互效应仍存在显著认知空白，这些相互作用可能因浓度和暴露条件而表现为拮抗或协同效应。Se尤其被认为可通过改变重金属生物利用度、促进金属-Se复合物形成以及调节氧化应激通路来调控重金属毒性。

本研究旨在探究As、Cd和Se单独及联合暴露对金鱼生物累积模式和氧化应激反应的影响，评估组织金属累积和关键氧化应激生物标志物，以阐明这些元素之间的机制性相互作用。研究采用210尾平均体重20 ± 8 g的金鱼，于2024年春季购自伊朗吉兰省商业渔场，运至库尔德斯坦大学兽医学院实验室。鱼类在控制条件下（20 ± 2°C；pH 7.5–8.5）驯化后，随机分配至21个玻璃水族箱（40 L/箱），每处理设3个独立重复，以水族箱为实验单位。暴露浓度基于既往文献报道的96小时半数致死浓度（LC₅₀-96 h）约10%设定：As为4 mg/L、Cd为2.8 mg/L、Se为2 mg/L，暴露持续14天。暴露结束后采集背侧白肌样本，使用超纯双蒸馏水和优级纯试剂进行样品前处理。组织经干燥、粉碎后，采用带有六点多元素标准曲线（R² ≥ 0.9999）的电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行金属定量分析，以干重为基础表示金属浓度。氧化应激生物标志物测定包括：采用240 nm处吸光度变化分光光度法测定CAT活性；基于硝基蓝四唑（NBT）光化学还原抑制法在560 nm处测定SOD活性；采用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法在532 nm处测定MDA水平；所有结果均以Bradford比色法测定的总蛋白浓度进行归一化。统计分析采用Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性，Levene's检验评估方差齐性，满足参数检验条件时采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验，并进行Pearson相关性分析。

研究主要结果如下。生存率方面，对照组最高，As组最低，但组间差异无统计学意义。体重结果显示，各组初始体重无显著差异（p > 0.05），最终体重均较初始值增加，且组间存在显著差异（p < 0.001），其中As+Se组最低，Cd+Se组最高。金属累积结果显示，肌肉As累积在对照组最低，Se和Cd暴露后显著改变（p < 0.001）；Cd浓度在对照组最低，As+Se处理组观察到Cd累积降低；Se水平在Cd和As联合暴露后较对照组显著降低。

氧化应激生物标志物方面呈现显著组间变异。MDA水平在Se组和As+Cd+Se组最高；SOD活性在As和Cd组最低，Se补充后As和Cd组的抗氧化活性升高；CAT活性在As和Cd组最低，As+Se和Cd+Se组显著升高（p < 0.01）。相关性分析显示：对照组中As浓度与MDA强正相关（r = 0.910, p < 0.001），Se与MDA呈弱负相关；As暴露组中As与MDA正相关（r = 0.769, p < 0.05），与SOD负相关（r = ?0.740, p < 0.05）；Cd组中Cd与MDA正相关（r = 0.710, p < 0.05），与SOD负相关（r = ?0.836, p < 0.05）；Se组中Se与SOD显著正相关（r = 0.890, p < 0.05），与MDA显著负相关（r = ?0.769, p < 0.05）。联合暴露组中，As+Se组As与MDA正相关（r = 0.723, p < 0.05）；Cd+Se组Se与CAT显著正相关（r = 0.748, p < 0.05），Cd与SOD负相关（r = ?0.720, p < 0.05）；As+Cd+Se组As与MDA正相关（r = 0.723, p < 0.05），Cd与MDA正相关（r = 0.627）。

讨论部分指出，水生生物食用方面的一大问题是重金属在其肌肉组织中的累积，这不仅对水生生物产生行为改变、生长受损和死亡率增加等不利影响，也因金属的持久性和生物累积性而对人类健康构成风险。金属在鱼组织中的累积受水中金属浓度及温度、pH、盐度和硬度等环境参数影响。本研究在控制实验条件下探讨了有毒金属与必需金属的潜在交互效应。研究发现As和Cd可能具有累积性和相对不可降解的效应，而Se暴露的调节作用可能表现为MDA水平降低和抗氧化酶活性增强。对照组中As浓度与MDA的显著相关性可能反映环境因素暴露，可能与西亚地区井水As污染背景有关。Cd和As作为重要环境毒物，其联合毒性效应尚不完全清楚。金属硫蛋白（MTs）在Cd解毒中起关键作用，但其参与As毒性可能更为复杂。不同研究对As暴露后MT水平变化报告不一，表明金属-金属相互作用可能取决于暴露条件和剂量。联合暴露下（尤其As+Se）观察到的组织累积降低可能反映影响吸收、分布或解毒过程的交互效应。金属在鱼组织中的分布也受代谢活性影响，肌肉中浓度通常低于肝脏等器官，这可能与MTs的金属结合和解毒作用有关。Se浓度在联合处理中较单独Se处理降低，可能提示Se与其他金属之间存在影响其生物利用度或组织掺入的相互作用。既往研究表明Se可能通过氧化还原平衡和抗氧化防御机制调节Cd和As的毒性，也可能通过与某些金属相互作用降低其毒性。处理组MDA水平升高反映脂质过氧化和氧化应激增强，而SOD和CAT活性降低则提示抗氧化防御系统受损。Se处理组相对改善的状态提示Se对氧化损伤具有保护或调节作用，与Cd和As联合暴露可部分抵消氧化应激，这可能与抗氧化酶活性改善和脂质过氧化减少有关。SOD和CAT作为细胞防御ROS的关键组分，其变化反映促氧化与抗氧化过程之间的平衡。

研究结论表明，As、Cd和Se的同时暴露显著影响水生生物的组织生物累积模式和生化反应。Se补充可显著降低As和Cd的组织累积，提示存在调节性和潜在拮抗性相互作用。As和Cd浓度与MDA水平一致呈正相关，与抗氧化酶特别是SOD呈负相关，表明其诱导氧化应激的作用明显。Se处理组中金属累积和氧化损伤的降低提示Se通过竞争性保护机制缓解As和Cd的毒性，但这种相互作用的幅度受暴露剂量、水质参数和物种特异性生理特征等多种环境和生物学因素影响。研究局限性在于仅评估肌肉组织生化终点，未包含全面分子评估。未来研究建议纳入关键抗氧化和应激相关酶的基因表达分析（如RT-PCR），并评估肝脏、肾脏和鳃等额外靶器官以提供更完整的毒理学特征；同时需延长暴露持续时间以评估慢性毒性和长期累积效应。此外，建议未来研究采用更全面的实验设计和扩大处理组，以更好评估不同环境条件下As、Cd和Se的交互效应。本研究贡献于重金属交互和累积效应的科学讨论，为环境毒理学和水生风险评估提供了有益见解。