《npj Biofilms and Microbiomes》：Phyllosphere microbiome responses to spray-induced gene silencing targeting Phytophthora infestans in potato
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摘要：近年来，利用RNA干扰（RNA interference, RNAi）控制丝状病原体的兴趣日益增长，为植物病害管理开辟了新领域。喷雾诱导基因沉默（spray-induced gene silencing, SIGS）等策略为化学病害防治提供了有效且环境友
摘要：近年来，利用RNA干扰（RNA interference, RNAi）控制丝状病原体的兴趣日益增长，为植物病害管理开辟了新领域。喷雾诱导基因沉默（spray-induced gene silencing, SIGS）等策略为化学病害防治提供了有效且环境友好的替代方案，但相关研究仍不充分。鉴于微生物组对植物健康和作物产量的深远影响，了解喷洒双链RNA（double-stranded RNAs, dsRNAs）如何影响植物微生物群落，对于推动SIGS从实验室走向实际大规模应用至关重要。因此，研究人员研究了在经济上重要的马铃薯植物叶际中，喷洒靶向植物病原体致病疫霉（*Phytophthora infestans*）的dsRNA后，细菌和真菌群落的变化。仅喷洒dsRNA对原生马铃薯叶际中优势物种的相对丰度影响甚微。然而，细菌群落的组成存在微小的随时间变化，而在接种*P. infestans*后观察到细菌群落指标发生更大幅度的变化。研究人员还观察到，在dsRNA处理的植物中，潜在有益细菌属的维持，以及与*P. infestans*感染后植物自然防御反应相关的组成变化。综上所述，这些观察结果支持了dsRNA喷洒能够实现对马铃薯安全且靶向的病原体控制的观点。
论文解读文章
**研究背景、问题与意义**
随着全球人口快速增长以及气候变化加剧的病虫害对农业生产带来的挑战，保障全球粮食安全成为重大议题。马铃薯（*Solanum tuberosum*）作为世界第三大主要粮食作物，深受病虫害威胁，其中致病疫霉（*Phytophthora infestans*）是影响马铃薯生产的最大病原体，引发晚疫病，导致叶片枯萎、块茎腐烂，年全球经济损失高达30至100亿美元。当前防控主要依赖抗性品种与化学农药，但由于*P. infestans*基因组变异快、效应蛋白基因存在，抗性品种效果有限；同时化学农药对人体健康和环境有负面影响，且病原体敏感性降低，加之欧盟等地区出台严格法规要求减少化学农药用量，亟需非化学替代方案。RNA干扰（RNAi）技术，特别是喷雾诱导的基因沉默（SIGS），通过外源双链RNA（dsRNA）沉默病原体靶基因，展现出可持续作物保护的潜力。前期研究表明，SIGS能有效抑制*P. infestans*对马铃薯叶片的感染，但关于喷洒dsRNA对叶面微生物群落的广泛影响尚不清楚。微生物在病害控制、养分循环、非生物胁迫耐受和促进植物生长中起关键作用，因此了解dsRNA对植物叶际微生物组的影响，对于SIGS从实验室走向大规模应用至关重要。该研究发表在《npj Biofilms and Microbiomes》，旨在评估靶向*P. infestans*基因（*PiGPB1*与*PiCut3*）的dsRNA喷洒对马铃薯叶际微生物组的影响。
**主要关键技术方法**
研究采用盆栽试验，供试材料为4周龄的马铃薯试管苗（品种Désirée），移栽至花盆后于控制气候条件下培养。关键技术方法包括：体外dsRNA合成（使用MEGAscript RNAi试剂盒，以*P. infestans* cDNA为模板）；叶面喷洒处理（每种dsRNA每株喷洒2 ml、10 μg，并设未处理NT、水喷W、非特异性dsRNA Nsp对照；接种*P. infestans*孢子囊悬液50,000个/ml）；样本采集（非接种样本于喷洒后24、48、72 h收集，接种样本于喷洒后48和72 h收集，每次3个生物重复）；DNA提取（DNeasy PowerSoil Pro试剂盒）；扩增子测序（靶向16S rRNA基因的799F-1115R引物对用于细菌，ITS1Kyo2F-ITS86R和半巢式ITS1oo/ITS3oo-ITS4引物用于真菌及卵菌，样本队列均为同一批144个样本中的部分）；生物信息学处理（QIIME2、DADA2等识别ASV，分类分别基于SILVA v138.1、UNITE v9.0及定制卵菌数据库）；群落组成与多样性分析（Simpson指数、Bray-Curtis相异度、PERMANOVA、ANCOM-BC差异丰度）；共现网络构建（SPIEC-EASI，Zi-Pi图识别关键物种）。
**研究结果**
**Overall counts and taxonomy assignments**：通过扩增子测序，从178个样本中获得共14,090,652条原始paired-end reads（细菌5,980,756条，真菌4,904,556条，卵菌3,205,340条）。质控后得到11,300,259条高质量reads，生成3,876个ASV（细菌3,114个，真菌713个，卵菌49个），归类到30个门（23个细菌门，6个真菌门，1个卵菌门）和663个属（473个细菌属，188个真菌属，2个卵菌属）。稀释曲线显示样本覆盖度足够。
**Bacterial community characteristics**：Simpson指数（α多样性）显示处理条件对细菌群落丰富度有显著影响（ANOVA，p=0.0058），但dsRNA处理与对照（NT、W）无显著差异。β多样性（Bray-Curtis相异度PCoA）揭示对照与dsRNA处理间有较大重叠，但不同采样时间存在分离（如24 h时ND、Nsp与dsRNA样本分离；48 h时Cut3处理样本单独聚类）。相对丰度显示，非接种样本主要优势属为*Sphingomonas*（16.51–30.42%）、*Pseudomonas*（5.87–8.53%）和*Methylobacterium*（8.88–18.80%）；接种样本主要优势属为*Acinetobacter*（3.79–42.25%）、*Sphingomonas*（9.79–19.28%）、*Methylobacterium*（5.91–23.91%）、*Pseudomonas*（7.53–13.82%）和*Serratia*（5.91–15.18%）。ANCOM-BC差异丰度分析显示，与ND相比，dsRNA样本中*Bacillus*、*Janibacter*和*Polymorphobacter*丰度增加，而*Rhodococcus*、*Chryseobacterium*、*Brevundimonas*、*Pseudomonas*和*Arthrobacter*减少；所有接种样本（ND+Pi、Nsp+Pi、dsRNA+Pi）中*Serratia*和*Acinetobacter*显著增加；dsRNA+Pi与ND相比，*Sphingomonas*和*Methylobacterium*增加，而*Rhodococcus*、*Brevundimonas*、*Chryseobacterium*、*Alkanindiges*及三个未分类ASV减少。
**Fungal community characteristics**：真菌群落的α多样性（Simpson指数）在所有处理间无显著差异。PCoA图显示各处理组间无显著聚类，对照与dsRNA处理（无论是否接种）之间存在较大重叠。相对丰度显示所有样本中相同属丰度较高，真菌组成在处理间变化不大。ANCOM-BC分析仅发现ND+Pi和dsRNA+Pi组与ND相比存在差异丰度ASV：*Cladosporium*和*Phaeoacremonium*在ND+Pi中减少，dsRNA+Pi中仅*Phaeoacremonium*减少；个别未分类ASV在接种样本中增加。卵菌reads监测到*Phytophthora*（99.53–100%）和*Pythium*（0–0.46%），但因数量太少无法稳健推断。
**Complexity and stability of bacterial and fungal community networks**：SPIEC-EASI网络分析显示，细菌网络在ND处理中有240个节点、691条边，dsRNA处理中有240个节点、665条边；真菌网络ND与dsRNA处理均有65个节点，边数分别为53和37。网络中正相互作用（共现）占主导（细菌网络96.52%/96.99%为正边，真菌网络100%为正边）。细菌网络节点主要属于Pseudomonadota、Actinomycetota、Bacteroidota和Bacillota；真菌节点属于Ascomycota和Basidiomycota。平均节点度：细菌ND为5.76，dsRNA为5.54；真菌ND为1.63，dsRNA为1.14。模块化分析显示细菌ND网络有10个模块，dsRNA有16个模块；真菌ND网络有11个模块，dsRNA有12个模块。Zi-Pi图鉴定出细菌ND网络中有6个关键ASV（模块枢纽），dsRNA网络中有7个，其中共同的关键ASV为ASV3（属*Sphingomonas*）和ASV659（属*R7C24*）；真菌ND和dsRNA网络各只有1个模块枢纽ASV（分别属于*Pascua*和*Paraphoma*）。
**总结讨论部分与结论翻译**
**讨论总结**：植物叶表栖居着多样的微生物群落，与植物相互依赖，影响生长、胁迫响应和抗病能力。研究显示，dsRNA喷洒改变了马铃薯叶际细菌群落，但PCoA图中未出现显著分离，时间因素影响组成变化；接种病原体后细菌群落变化更大。*Serratia*和*Acinetobacter*的富集可能与植物对病原入侵的响应有关；*Sphingomonas*和*Methylobacterium*在dsRNA接种样本中选择性增加，可能有助于富集有益细菌。核心细菌微生物组在所有处理中保持不变，表明dsRNA未改变细菌丰富度和多样性。真菌群落基本不受影响，结构和组成稳定，与细菌相比真菌更稳定。网络分析显示dsRNA喷洒后微生物群落网络保持稳定；关键物种（ASV3 *Sphingomonas*、ASV659 *R7C24*）在多种处理中作为模块枢纽，提示其在微生物互作和生物防治中的潜在作用。研究结果与前期在单子叶植物上的发现相似，支持SIGS的安全性与靶向特异性。
**结论翻译**：近年来，将非编码RNA（包括dsRNA和sRNA）用于植物保护的需求日益增长。通过SIGS有效利用其病害控制潜力，需要深入了解其对宿主植物及其微生物组的影响。本研究表明，dsRNA喷洒并未显著改变马铃薯叶际细菌和真菌群落的多样性。然而，细菌群落在组成上出现了时间依赖性的小幅变化，且由*P. infestans*接种驱动的组成变化更为显著。网络分析同样表明，dsRNA喷洒对微生物群落的组装无显著影响。这些结果支持了初期关于dsRNA喷洒安全性和靶向特异性的假设。大量研究表明，植物微生物组受地理位置、宿主品种、污染物、季节变化等多种因素影响，因此，建议在田间水平开展包含多个植物基因型和更广泛采样时间的补充研究，以更全面了解SIGS过程中塑造微生物群落的复杂机制。
