综述：溶瘤细菌的合成生物学：比较微生物底盘与精准杀伤策略

《Toxicology Reports》：Synthetic biology of oncolytic bacteria: Comparative microbial chassis and precise killing strategies

　　

合成生物学领域已成为一种革命性工具，用于工程化改造能够实现精准、程序化癌症治疗的微生物。与传统癌症疗法缺乏安全、选择性毒性不同，工程化微生物细胞能够检测肿瘤特异性信号、靶向低氧环境，并在空间和时间上更有效地递送细胞毒性载荷。本综述介绍了微生物底盘工程的最新进展，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、梭菌（Clostridium）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、霍乱弧菌（Vibrio cholera）、志贺氏菌属（Shigella species）和单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes），以及它们通过毒素递送、前药转化、免疫调节和肿瘤特异性表面展示在靶向癌症治疗中的潜在用途。研究人员讨论了增强安全性、特异性和遗传稳定性的关键合成生物学技术，包括基于成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（CRISPR/Cas9）的基因组编辑、遗传逻辑电路和杀伤开关系统。本综述重点阐述了合成生物学在开发具有精准靶向能力和增强治疗稳定性的溶瘤细菌中的作用。通过分析比较微生物底盘和实施精准杀伤策略，研究人员探讨了当前的临床挑战并探索了溶瘤细菌疗法的未来。

论文主体部分以学术专业性文字总结如下：

1. 引言
癌症是全球最重大的公共卫生挑战之一，每日超过52,900人被确诊，死亡人数超过27,000。尽管在识别新风险因素、开发早期诊断生物标志物和推进替代治疗策略方面付出了广泛努力，恶性疾病仍是全球第二大死亡原因。预计到2040年，全球将有2800万新发癌症病例和1620万癌症相关死亡。许多用于癌症治疗的合成化合物和常规化疗药物通常缺乏肿瘤选择性，不仅杀伤癌细胞，也伤害健康细胞并促进耐药性发展。与传统疗法不同，活细菌能主动穿透肿瘤深处，绕过靠近血管的聚集区域。溶瘤细菌疗法利用特定细菌的特性靶向并消除癌细胞，这些细菌能靶向传统疗法常难以处理的实体瘤低氧区域。细菌可通过产生毒素、酶和生物表面活性剂等多种机制发挥抗肿瘤作用。许多兼性或专性厌氧菌，包括沙门氏菌属（Salmonella species）、大肠杆菌（Escherichia coli）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、李斯特菌（Listeria）和梭菌（Clostridium），具有靶向并杀死肿瘤的能力。肿瘤微环境（TME）的独特特征使细菌能选择性增殖和定植。例如，沙门氏菌（Salmonella）在肿瘤中的定植密度可达正常组织的10,000倍以上。然而，在TME中平衡细菌逃避宿主抗菌防御与激活抗肿瘤免疫仍具挑战性。溶瘤细菌在多项试验中显示出有效消退肿瘤的能力，但全身毒性、治疗效果有限和不可预测的细菌复制等问题使其临床应用复杂化。微生物可被遗传改造以产生抗癌药物、增强免疫系统并改善治疗特性。合成生物学的进步允许通过减弱毒力特征和添加定制治疗载荷来合理设计改良的溶瘤细菌菌株，其中一些候选者已进入临床评估。

2. 历史背景
微生物（主要是细菌）与人类疾病（包括癌症）之间存在着公认的联系。自19世纪起，细菌就被用于治疗癌症。1867年，德国医生Wilhelm Busch记录了一例癌症患者在感染丹毒（现称为化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes））后肿瘤缩小。19世纪末，William B. Coley观察到头颈癌患者在感染后显著缓解，并开发了“科利毒素”（Coley's toxin），即热灭活的化脓性沙雷氏菌（Serratia pyogenes）和黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的静脉输注。在接下来的40年中，“科利毒素”使多种肉瘤患者获得不同程度的缓解，其10年生存率与现代常规治疗相当。Coley被称为“癌症免疫疗法之父”。他的研究启发了基于细菌的癌症疗法，开创了癌症治疗的新时代。然而，到20世纪中期，细菌致癌概念在科学和医学机构中基本失宠。直到20世纪末，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的发现建立了细菌感染与胃癌之间的联系，才扭转了这一教条式的否定，重新激发了该领域的兴趣，并为现代研究精确的细菌-癌症分子相互作用开辟了道路。

3. 驱动细菌选择性肿瘤定植的因素
细菌癌症疗法的基础是其通过独特机制特异性靶向肿瘤的能力。TME中存在的生化和生理线索促进了细菌的定植和生长。TME是一个由细胞和非细胞成分组成的异质性网络，通过持续提供营养支持肿瘤生长、进展和扩散，同时限制有效药物递送并损害免疫监视。化学吸引物（如营养物）的可用性促进了细菌增殖。肿瘤产生并释放乳酸、不同氨基酸和糖化合物等代谢物，为细菌提供营养。此外，TME释放多种趋化信号，包括趋化因子和生长因子（如转化生长因子-β（TGF-β）和血管内皮生长因子（VEGF）），将细菌驱动进入TME。一些细菌物种依赖群体感应（quorum sensing）来控制其在肿瘤内的种群动态和行为。TME的免疫景观变化也显著促进了肿瘤内细菌群落的增长。肿瘤内环境通常具有免疫抑制性，以肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）为特征，降低了针对肿瘤和入侵细菌的免疫应答有效性。溶瘤细菌被动渗透肿瘤组织并被困在肿瘤紊乱的循环系统中，引发炎症。例如，在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）肿瘤定植的早期阶段，肿瘤坏死因子α（TNF-α）引起血管破坏，使细菌通过血流进入肿瘤。李斯特菌属（Listeria species）通过细胞内感染选择性靶向恶性细胞，并感染MDSCs以逃避宿主免疫系统。泄漏的血管还表现出增强渗透和滞留（EPR）效应，但EPR效应依赖于可能不成立的假设。除被动积累外，低氧TME是关键靶点。缺氧是几乎所有实体瘤TME的标志，创造了微生物可利用的独特生理环境。梭菌（Clostridium）、沙门氏菌（Salmonella）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等细菌病原体在低氧环境中生长良好。毒性靶向也被报道，例如梭菌（Clostridium）的外毒素可破坏癌细胞膜、抑制重要生物活动并消除肿瘤。此外，微生物细胞表面展示系统通过将肽和蛋白质展示在微生物细胞表面，支持更精确的分子肿瘤诊断和“智能子弹”疗法的开发。

4. 安全性和精准度的合成控制系统
当使用特定细菌对抗癌症时，必须降低其对宿主免疫系统的毒力，同时注意某些细菌的内在抗癌活性源于其毒力因子。因此，减毒不应导致抗癌活性的丧失。常用遗传编辑方法包括编辑脂质A生物合成以降低外膜囊泡（OMVs）中的内毒素毒性，例如敲除鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中产生脂质A酰基转移酶的msbB基因，导致脂质A欠酰化，显著降低微生物引发全身脓毒性休克的能力。另一种减毒沙门氏菌菌株通过降低内毒素相关基因的表达或抑制其功能活性而创建。缺失relA和spoT基因的沙门氏菌菌株（ΔppGpp）缺乏合成ppGpp的能力，LD₅₀值比野生型菌株高10⁵–10⁶倍。缺失phoP和phoQ基因（编码关键双组分系统，作为主要毒力调节因子）不会损害沙门氏菌的抗癌活性，但降低了其在正常组织中的毒力。单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的细胞毒性通过删除参与细胞侵袭和吞噬溶酶体释放的基因（如HIy缺失）实现。遗传工程在细菌递送系统中发挥关键作用，通过使用质粒、噬菌体、基因电路和基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）操纵细菌基因组。合成生物学的进展使细菌能够通过遗传电路感知并对特定刺激做出反应。自杀开关是一种基因电路机制，在特定条件下产生程序性自溶。例如，一种改良的沙门氏菌菌株由PsseJ启动子驱动，该启动子在细菌处于细胞内环境时触发，导致溶菌酶LysE的发育，引起细菌自发裂解。另一种方法使用通过物理条件（如蓝光）诱导的自杀开关，例如大肠杆菌（Escherichia coli）菌株EcN-pDawn-φx174E/TRAIL，在蓝光照射下裂解并释放肿瘤凋亡诱导配体TRAIL。检测复杂环境条件需要多输入遗传逻辑门，这些逻辑门被设计用于检测癌症特异性标志物，例如AND门可编程要求同时存在两种标志物才能激活，防止健康组织中的脱靶效应。

5. 微生物底盘比较分析
肿瘤中已发现大肠杆菌（E. coli）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、梭菌属（Clostridium species）、双歧杆菌属（Bifidobacterium species）、霍乱弧菌（Vibrio cholera）、志贺氏菌属（Shigella species）和单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）等微生物，其中一些已通过野生型或基因改造菌株用于肿瘤治疗。溶瘤疗法可通过其毒素、酶、生物膜和其他次级代谢产物以及孢子实现，直接或间接破坏癌细胞。大肠杆菌（E. coli）和沙门氏菌属（Salmonella species）是兼性厌氧菌，可在有氧和低氧环境中生长，具有多功能性。在设计溶瘤疗法方面，大肠杆菌（E. coli）因其易于编程实现精确肿瘤靶向和治疗递送而优于沙门氏菌（Salmonella）。非病原性菌株如Nissle 1917因其安全性、在低氧实体瘤中定植的能力和遗传可操作性而受到重视。该菌株已被工程化以表达pH（低）插入肽（pHLIP），可快速运输抗肿瘤药物。大肠杆菌（E. coli）菌株K-12也被用于癌症治疗，经遗传改造产生溶血蛋白ClyA。此外，来自肠出血性大肠杆菌（E. coli O157）的志贺样毒素I在混合益生菌上清液中对Caco-2细胞系表现出抗癌活性。沙门氏菌属（Salmonella spp.）以其优越的运动性和“肿瘤归巢”特性而闻名，在肿瘤中浓度较高（通常为10⁸ CFU/g），且持久性更强。梭菌属（Clostridium spp.）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等厌氧菌可通过直接注射或全身注射靶向低氧区域。与兼性厌氧菌不同，专性厌氧菌提供天然遏制作用，因为它们无法在肿瘤坏死中心之外存活。非毒性诺维氏梭菌（Clostridium novyi-NT）处于肿瘤坏死疗法前沿，通过诱导坏死和细胞裂解减慢肿瘤生长。它已完成I期临床试验，并通过与促炎细胞因子如IL-6、MIP-2、TIMP-1和G-CSF相互作用增强炎症反应。梭菌（Clostridium）还被用作肿瘤特异性基因递送载体，用于梭菌导向酶前药治疗（CDEPT）。双歧杆菌（Bifidobacterium）是存在于人体肠道中的非病原性益生菌，被视为更安全的选择，但通常不自然杀死肿瘤细胞，主要作为治疗剂递送载体。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是内部化进入宿主细胞质并释放抗肿瘤药物的细胞内载体，可表达肿瘤相关抗原（TAAs）并产生孔形成蛋白李斯特菌溶素O（LLO）。志贺氏菌（Shigella）具有III型分泌系统，能够将毒性蛋白递送到宿主细胞质中，并已被改造以优先内化到胶质母细胞瘤细胞中。

6. 细胞毒性载荷与杀伤策略
基于细菌的抗癌疗法记录了多种杀伤策略。直接癌细胞裂解是一种策略，溶瘤细菌直接侵入癌性组织，释放损伤细胞功能的毒素和裂解细胞的酶。例如，非毒性诺维氏梭菌（Clostridium novyi-NT）产生α毒素，破坏细胞膜导致细胞破裂。沙门氏菌（S. typhimurium）合成细菌蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡。此外，溶瘤细菌可通过营养耗竭破坏癌细胞，低氧区域促进专性厌氧菌生长，营养和氧气供应减少导致坏死区域形成和肿瘤细胞死亡。免疫应答诱导是另一个关键杀伤策略。溶瘤细菌直接攻击并损伤癌细胞，引起肿瘤相关抗原释放，诱导更强的宿主免疫应答，增强先天性和适应性免疫。肿瘤相关抗原持续产生促进树突状细胞（DC）迁移和激活，进而呈递抗原给T细胞，产生适应性免疫应答。另一种策略涉及细菌毒素和免疫毒素，其优势在于效力强（小剂量即可有效）以及可通过遗传工程创建融合蛋白（如免疫毒素）提高靶向特异性。成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（CRISPR-Cas9）基因组编辑技术已革命性地用于产生多种重组溶瘤菌株。最近的突破使用CRISPR/Cas9切口酶（Cas9n）永久武装诺维氏梭菌（Clostridium novyi-NT），利用其自然同源导向修复（HDR）实现治疗载荷的稳定染色体整合。另一种策略是抗体-药物偶联物（ADCs），利用细菌毒素破坏关键细胞过程。ADC包括抗体、细胞毒性载荷和连接子三部分，抗体选择性结合肿瘤细胞表面抗原，内化后连接子被裂解，释放细胞毒性载荷诱导DNA损伤或抑制细胞分裂。某些载荷表现出“旁观者效应”，即细胞内释放的药物扩散到邻近抗原阴性细胞并诱导死亡。细菌导向酶前药治疗（BDEPT）是另一种策略，使用无活性化合物（前药），仅在被细菌酶定位于肿瘤部位时才转化为有毒药物。BDEPT是两阶段治疗：第一阶段给予武装载体靶向肿瘤并表达酶，第二阶段给予前药，酶在肿瘤部位特异性转化为细胞毒性药物。此外，天然衍生的细菌成分（如代谢物、生物表面活性剂、生物膜和孢子）已被证明是有效的内在杀伤策略。

7. 临床转化与失败模式
尽管临床前结果令人鼓舞，但基于微生物的癌症疗法的临床转化受到宿主免疫应答、安全考虑和监管挑战的抑制。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）VNP20009的I期试验明显体现了这一差距，显示优先肿瘤定植但未达到足够的治疗优势。宿主防御机制迅速识别并破坏改造后的微生物，限制其持久性、肿瘤内扩散和成功的载荷递送。此外，全身暴露于细菌成分和表达毒素引发的安全担忧限制了可施用的剂量。即使细菌成功定植，治疗效果也可能因遗传不稳定而受损。杀伤开关系统尤其容易受到这种不稳定的影响，因为其整合的毒性基因即使在关闭状态下也可能因泄漏表达而产生有害效应，造成功能丧失突变体的选择性压力。在CRISPR/Cas系统中，多重基因组编辑效率仍相对较低，可能发生脱靶效应。生物安全和监管框架直接受这些生物学和工程不确定性影响。对合成生物的担忧包括生物安全危险（如意外释放）和生物安保威胁（如故意滥用）。社会科学家强调了潜在危害，包括水平基因转移、破坏当地生态系统和生物多样性、与工程生物体的意外相互作用，以及更广泛的伦理、法律和社会考虑。尽管尚未有重要的生物安保或生物安全事故报告，但各国、研究人员、机构和全球社区必须考虑治理和监管框架以避免潜在风险。

8. 未来工程策略
合成生物学是一个快速发展的多学科科学，正在改变癌症疗法，使改造微生物成为先进的活体治疗剂。遗传电路可阻止细菌在有氧环境中生长，以增强自然靶向能力，限制癌症扩散并保护健康组织。未来成功将细菌疗法从实验室转移到临床需要更深入地理解作用机制、发展全面的监管框架以及整合多种技术平台。通过遗传工程改善细菌肿瘤选择性是关键领域。可产生表达肿瘤特异性配体或单域抗体的改造细菌。例如，沙门氏菌（Salmonella）菌株已被改造以表达整合素结合肽RGD，显示出增强的抗癌活性和肿瘤选择性。其他技术如ClosTron方法（基于TargeTron平台）已实现靶基因插入梭菌（Clostridium）。添加可诱导基因电路，如通过基因编码电路限制细菌激活或增殖，可进一步提高精准度。治疗载荷可根据不同肿瘤环境定制：对于“热”肿瘤，细菌递送免疫调节剂（如细胞因子、肿瘤抗原）以增强抗肿瘤免疫；对于“冷”肿瘤，表达直接杀伤效应物（如毒素、凋亡蛋白）。逻辑门设计可提高肿瘤治疗精准度，例如大肠杆菌（E. coli）Nissle 1917已被设计在低氧、低pH和高乳酸的TME条件下释放溶血素，或构建AND逻辑门确保仅在乳酸和酰基高丝氨酸内酯（AHL）同时存在时释放治疗蛋白。此外，改造的活溶瘤细菌与纳米材料、溶瘤病毒疗法等其他抗癌技术结合可改善治疗覆盖范围、克服单一疗法限制并增强肿瘤杀伤能力。将基于细菌的疗法与检查点抑制剂或标准化疗等现有模式结合，可改进肿瘤免疫应答。合成生物学与个性化医学结合开发溶瘤细菌有潜力变革治疗方法。基于肿瘤的遗传、分子和细胞特征选择药物可提高疗效并减少副作用。例如，在活体生物治疗药物（LBSs）开发中，梭菌（Clostridium）可根据癌症类型和免疫系统进行个体化使用。

9. 结论
微生物癌症疗法已从概念框架发展为快速扩展的治疗基础设施，这主要归功于合成生物学的进步。该学科使创建具有更高安全性、可控细胞毒性活性和特异性肿瘤靶向能力的可编程装置成为可能。如今，工程化细菌能够运输前药或细胞毒性化学物质、识别肿瘤特异性信号、激活合成基因电路并调控免疫微环境。基因组编辑、杀伤开关机制和表面展示方法的进展大大提高了基于微生物疗法的生物安全性、可控性和适应性。然而，仍然存在重大障碍，包括遗传不稳定、脱靶毒性、不足的肿瘤定植、免疫介导的清除、生产限制和监管限制。解决这些问题需要更可靠和稳定的合成电路、更好的时空调控、统一的生物安全措施以及更全面的计算建模和合理设计技术整合。总之，定制化细胞毒性微生物是一种有前景的下一代肿瘤治疗方法，可能补充甚至超越传统治疗策略，但需要持续的合成生物学创新、严格的临床前验证和精心设计的临床试验。