利用新开发的免疫活性结肠上皮单层共培养模型进行炎症性肠病的体外建模研究

《npj Biomedical Innovations》：In vitro modeling of inflammatory bowel diseases using a newly developed immunocompetent colon epithelial monolayer co-culture model

　　

摘要：由于肠上皮屏障、免疫系统与肠道菌群之间相互作用的复杂性，炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）的临床治疗仍具挑战性。尽管体外模型对研究屏障功能障碍至关重要，但建立标准化且具功能相关性的IBD研究体系仍较困难。为此，研究人员建立了一种免疫活性小鼠结肠上皮单层（immunocompetent murine colon epithelium monolayer）以模拟IBD样病理状态。将野生型小鼠结肠消化为单细胞并接种于Matrigel包被的Transwell小室，7天内单层即表现出强屏障特性，并分化为含杯状细胞、干细胞及肠内分泌细胞的各上皮细胞谱系。促炎细胞因子及致病菌（柠檬酸杆菌Citrobacter rodentium和鼠伤寒沙门菌Salmonella Typhimurium）暴露可破坏上皮完整性。为更好地模拟体内状态，研究人员将极化T细胞与巨噬细胞共培养于上皮单层上——促炎性Th1与Th17细胞损害屏障功能，而M0与M2巨噬细胞则维持屏障功能，再现了肠道稳态与炎症状态。鼠伤寒沙门菌感染时，M1巨噬细胞产生IFN-γ，M2巨噬细胞分泌IL-10并促进紧密连接蛋白ZO-1表达。综上，该模型为研究上皮屏障功能障碍、免疫-上皮互作及宿主-病原体相互作用提供了有前景的平台，可为阐明IBD机制及开发潜在治疗策略提供有价值的信息。

论文解读：利用新开发的免疫活性结肠上皮单层共培养模型进行炎症性肠病（IBD）的体外建模研究

本研究发表于《npj Biomedical Innovations》。炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD），包括克罗恩病（Crohn's Disease, CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC），其发病机制涉及遗传、免疫失调、环境及菌群因素共同作用于肠上皮屏障。传统动物模型虽能模拟部分病理特征但存在伦理限制及物种差异；常规永生化细胞系（如Caco-2）缺乏原代上皮细胞多样性且无法反映体内稳态；三维肠类器官（intestinal organoids）虽能保留上皮谱系却因封闭囊腔结构难以直接接触顶端（apical）侧以研究屏障通透性及宿主-病原体互作。因此，研究人员旨在建立一种可直接接触两侧、含原代结肠上皮细胞且整合适应性与固有免疫组分的二维单层共培养模型，以更真实地模拟IBD中上皮-免疫互作及细菌侵袭过程。

主要关键技术方法：

研究人员从8–12周龄野生型C57BL/6J小鼠结肠分离隐窝并消化为单细胞，接种于Matrigel包被的Transwell（0.4 μm孔径）小室，先后使用含Rock抑制剂（Y-27632）的隐窝培养培养基（Crypt Culture Medium, CCM）与分化培养基（不含Y-27632）诱导形成融合单层。从同品系小鼠脾脏负选纯化初始CD4⁺CD25^-T细胞，经抗CD3/CD28及细胞因子极化获得Th0、Th1（IL-12＋抗IL-4）和Th17（TGF-β omitted/IL-6＋IL-23＋IL-1β＋抗IL-4＋抗IFN-γ）亚群；从骨髓祖细胞经M-CSF诱导分化为巨噬细胞并经LPS＋IFN-γ（M1）或IL-4（M2）极化，未刺激者为M0。共培养时将免疫细胞加入单层基底外侧（basolateral）侧。分别用TNF-α与IFN-γ单独或联合刺激单层模拟炎症因子环境；顶端侧感染鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium，mCherry标记）与鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium，GFP标记）观察细菌黏附、移位及免疫细胞调控作用。通过跨膜电阻（Transepithelial Electrical Resistance, TEER）、荧光素通透实验、免疫荧光染色检测上皮细胞标志物（EpCAM、Muc2、Chga、Lgr5）及紧密连接蛋白ZO-1、Ki67增殖与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）死细胞染色，并用酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测培养上清IFN-γ、IL-17A、IL-10。

研究结果：

In vitro colon epithelial monolayers display in vivo-like characteristics

结肠隐窝单细胞接种后第3天附着生长，第7天达>98%汇合；Ki67阳性率下降表明向分化转变。免疫荧光证实存在上皮细胞标志EpCAM、杯状细胞标志黏蛋白2（Mucin 2, Muc2）、肠内分泌细胞标志嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A, Chga）及约11.40% Lgr5⁺干细胞，证明单层保留了主要结肠上皮细胞谱系及再生潜能。

In vitro-generated colon epithelial monolayers show robust barrier function

随时间推移荧光素透过率由第3天2.16%降至第7天0.94%，表观渗透系数（apparent permeability, P_app）显著下降，TEER由第3天约60 Ω·cm²升至第7天约321 Ω·cm²，紧密连接蛋白ZO-1沿细胞边缘连续表达。相比传统由3D类器官铺展的单层（需约21天达汇合），本方法7天成层且TEER更高，并可维持培养至22天。

Exposure of colon monolayers to pro-inflammatory cytokines reduces barrier integrity

TNF-α单独处理24 h对TEER及通透性与对照无显著差异；IFN-γ单独使归一化P_app升至216.20%、TEER降至36.60%并下调ZO-1表达；二者联用致最显著破坏（归一化TEER 19.80%，P_app311.90%），ZO-1表达进一步降低，PI⁺死细胞比例由0.17%升至约5.07%，说明协同破坏屏障并诱导上皮细胞死亡。

Establishment of immunocompetent co-cultures of monolayers with polarized T cells show compromised barrier integrity

与极化T细胞共培养24 h，Th17组TEER降至46.65%（对照Th0为93.60%），Th1组降至75.20%；ZO-1面积显著减少（Th17: 6.07%，Th1: 4.11%，对照: 8.81%）。上清中Th17产IL-17A（6271 pg/ml），Th1产IFN-γ（233.45 ng/ml），重现了IBD中效应T细胞对屏障的损害作用。

Immunocompetent co-cultures of monolayers with polarized macrophages mimic homeostasis

M0与M2巨噬细胞共培养对TEER及ZO-1无显著影响，模拟稳态维持；M1共培养TEER略降（147% vs 单层216%）但ZO-1未明显减少。M1上清IFN-γ升高（722.9 pg/ml），M2上清IL-10升高（468.66 ng/ml），体现巨噬细胞双重角色。

Immune cell regulation of the epithelial barrier in response to pathogenic bacteria

柠檬酸杆菌3 h黏附顶端侧、6 h移位至基底侧并致TEER下降与细胞死亡；预用IFN-γ或IFN-γ＋TNF-α处理加速其移位与屏障破坏。鼠伤寒沙门菌感染15 min即损伤上皮，3 h几近完全破坏屏障。与巨噬细胞三重共培养发现：M2巨噬细胞共培养使感染后TEER相对恢复（12.42% vs 仅菌感染3.28%）、ZO-1表达增强并分泌IL-10；M1产IFN-γ且轻微降低TEER；所有巨噬细胞亚群均提升上皮DAPI⁺活细胞比例，显示M2具保护/修复作用。

讨论与结论（翻译浓缩）：

IBD可由上皮屏障完整性紊乱触发，肠上皮不仅是物理屏障，还响应菌群与免疫信号。虽然3D类器官是重要工具，但其封闭结构限制顶端侧操作；传统Caco-2单层不能反映原代上皮行为。本研究报道的小鼠结肠上皮单层由组织直接解离获得，7天形成具体内样谱系（EpCAM⁺、Muc2⁺、Chga⁺、Lgr5⁺）与强屏障功能（ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin表达），快于类器官来源单层并可长期维持。该模型对IBD相关刺激具预期反应：IFN-γ及TNF-α＋IFN-γ下调紧密连接并诱导死亡；Th1/Th17损害屏障（伴IFN-γ/IL-17A分泌），M0/M2不破坏屏障（M2在细菌感染时上调IL-10、增强ZO-1与TEER）；柠檬酸杆菌与鼠伤寒沙门菌感染致屏障破坏并被M2巨噬细胞部分缓解。此免疫活性共培养体系填补了原代结肠上皮与功能性免疫细胞整合体外模型的空白，可用于研究上皮屏障功能障碍、免疫-上皮串扰及宿主-病原体互作，为IBD机制研究与药物筛选提供补充体内实验的平台。未来拟纳入成纤维细胞/内皮细胞及扩展至人类原代细胞。