BCG Hsp70–抗CD123免疫偶联物在儿童急性髓系白血病中的靶向疗效

《Pediatric Research》：Targeted efficacy of BCG Hsp70–anti-CD123 immunoconjugate in childhood acute myeloid leukemia

　　

背景：儿童难治/复发性急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）仍具挑战，原因在于白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs）以及弱的免疫原性。本研究旨在构建一种新型免疫偶联物，将卡介苗热休克蛋白70（BCG heat shock protein 70, HSP70）与抗CD123单克隆抗体（monoclonal antibody, MAb）结合，并评估其靶向抗白血病疗效及机制。方法：通过SPDP交联剂合成偶联物（HSP70-MAb），利用电喷雾电离质谱（ESI-MS）和紫外分光光度法进行表征。通过流式细胞术评估抗原结合活性。体外评估自体T细胞增殖（CFSE染色）、IFN-γ分泌（ELISA）以及细胞毒性活性（LDH释放）。体内在MOLM13异种移植裸鼠模型中评估抗白血病效果。结果：HSP70-MAb偶联物显示高纯度（96.2?±?1.5）%和接近1:1的摩尔偶联效率，并保留抗原结合活性。体外，HSP70-MAb显著增强自体T淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌，并以效应细胞:靶细胞（E:T）比例依赖性方式显著增强CTL介导的对CD123⁺ AML细胞的细胞毒性。体内，HSP70-MAb显著减小肿瘤体积，强烈刺激MOLM13特异性Th1细胞生成，并在肿瘤组织中诱导凝固性坏死及大量CD8⁺ T淋巴细胞浸润。结论：BCG HSP70/抗CD123免疫偶联物通过增强免疫原性和T细胞免疫发挥强效靶向抗白血病作用，为儿童AML（尤其是难治/复发性病例）提供了有前景的治疗候选药物。意义：研究人员构建了保留结合/免疫活性的HSP70/抗CD123 MAb偶联物，通过增强免疫原性和T细胞免疫在体外/体内发挥强效靶向抗白血病作用。靶向LSCs/微小残留病（minimal residual disease, MRD），其效果优于单一药物，填补了儿童AML CD123⁺ LSC靶向免疫增强的空白。该偶联物提供了一种新的免疫疗法，为清除LSCs/MRD的抗AML药物奠定了临床前基础。它建立了一种HSP70-MAb偶联方法，为其他血液/实体肿瘤提供了新思路。该高质量偶联物显示出强抗肿瘤效果且无显著毒性，加速了其在儿科肿瘤学中的转化应用。

**研究背景与意义**
儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）占全部儿童白血病的约20%，其复发率超过30%，5年总生存率低于50%，临床结局远不理想。越来越多的证据表明，白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs）的耐药性和微小残留病（minimal residual disease, MRD）是导致治疗失败和疾病复发的核心因素。此外，白血病细胞特异性抗原的免疫原性差，导致宿主无法产生有效的抗肿瘤免疫反应，这是AML持续存在的另一关键机制。传统的标准化综合治疗已无法进一步提升生存率。抗CD20、抗CD33等单克隆抗体（monoclonal antibody, MAb）及其免疫偶联物在血液肿瘤中已取得满意临床效果。CD123是LSCs最具特异性的标志物之一，在大多数未成熟AML细胞中过表达，且与高危遗传学改变和不良预后相关，是重要的免疫治疗靶点。然而，单独使用抗CD123 MAb因白血病细胞免疫原性差和抗肿瘤免疫应答弱而疗效有限。卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）热休克蛋白70（HSP70）作为免疫优势抗原，可充当佐剂刺激针对肿瘤抗原的强效免疫应答，无需额外佐剂。研究人员既往研究证实，将BCG HSP70基因转染至白血病细胞可显著增强其免疫原性，并诱导特异性抗白血病肿瘤免疫。基于此，研究人员提出假说：将BCG HSP70与抗CD123 MAb偶联，借助抗CD123 MAb的靶向作用，将BCG HSP70递送至LSCs和MRD细胞微环境，增强白血病细胞免疫原性，触发特异性抗肿瘤免疫应答以清除耐药和残留白血病细胞。本研究构建了BCG HSP70/抗CD123 MAb免疫偶联物（HSP70-MAb），在体外和体内评估其抗白血病疗效和机制，旨在为儿童难治/复发性AML提供新治疗策略。论文发表在《Pediatric Research》。

**主要关键技术方法**
研究人员从初诊AML患儿（招募期2025年3月1日至6月30日）骨髓中分离单个核细胞，通过MoFlo分选获得CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞作为LSCs，在骨髓基质及细胞因子（IL-3、G-CSF、TPO）条件下扩增培养。采用异双功能交联剂N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）将BCG HSP70与抗CD123 MAb通过二硫键偶联，经透析、凝胶过滤层析和冷冻干燥纯化获得HSP70-MAb。通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）和紫外分光光度法（UV）验证偶联物纯度及摩尔偶联效率。间接流式细胞术检测抗原结合活性。体外以CFSE染色、ELISA和LDH释放法分别评估自体T细胞增殖、IFN-γ分泌和细胞毒活性。体内建立MOLM13异种移植裸鼠模型，通过瘤内注射给药，检测肿瘤体积变化、MOLM13特异性Th1细胞（IFN-γ ELISPOT）、肿瘤组织H&E染色及CD8免疫组化（IHC）。

**研究结果**
**表型测量LSCs**：培养0天和7天后，CD34⁺CD38^-CD123⁺表达率分别为（86.41±3.77）%和（87.12±3.31）%，差异无统计学意义（P>0.05），表明LSCs表面标志物稳定。

**HSP70-MAb免疫偶联物的表征和抗原结合活性**：ESI-MS在约220 kDa处检测到新分子量峰（对应BCG HSP70 70 kDa与抗CD123 MAb 150 kDa之和）；UV显示蛋白纯度为（96.2±1.5）%，摩尔偶联效率为1.02:1。间接FCM显示抗CD123 MAb和HSP70-MAb的抗原结合阳性率分别为98.89%和96.71%，差异无显著性（P>0.05），表明偶联物保留了母体抗体的结合活性。

**HSP70-MAb增强白血病细胞免疫原性**：CFSE染色显示，对照、抗CD123 MAb、BCG和HSP70-MAb组的自体T细胞增殖阳性率分别为（15.36±0.21）%、（16.33±0.17）%、（31.67±1.28）%和（51.42±1.07）%，HSP70-MAb组显著高于其他组（P<0.05）。ELISA检测IFN-γ浓度，上述各组分别为（88.61±3.42）、（88.96±3.43）、（136.11±2.65）和（190.30±3.31） ng/L，HSP70-MAb组最高（P<0.05）。

**体外靶向细胞毒活性**：LDH释放实验显示，随着效应细胞与靶细胞比例（E:T）从10:1增至80:1，HSP70-MAb组的杀伤率显著高于对照、抗CD123 MAb和BCG组，且同一比例下CTL抑制活性持续上升，表明偶联物具有显著靶向治疗效果。

**体内抗白血病功效**：MOLM13细胞皮下接种裸鼠成瘤率100%，H&E染色见肿瘤细胞异型性明显，CD123 IHC阳性。治疗后，PBS组和T细胞组肿瘤体积增加（变化量+320.73和+113.56 mm3），而BCG组和HSP70-MAb组肿瘤体积显著减小（变化量-88.44和-154.90 mm3），后者缩小更明显（P<0.05）。IFN-γ ELISPOT显示，HSP70-MAb组小鼠脾脏中MOLM13特异性Th1细胞数量显著高于BCG组和T细胞组（P<0.05）。H&E染色见HSP70-MAb组肿瘤组织明显凝固性坏死，细胞核固缩溶解；IHC染色显示该组肿瘤组织中有大量CD8⁺ T淋巴细胞浸润，显著多于BCG组，而PBS和T细胞组几乎无浸润。

**讨论与结论**
讨论部分指出，AML患者存在具有自我更新和耐药能力的LSCs，传统化疗难以清除，同时白血病细胞免疫原性差及免疫抑制微环境阻碍宿主抗肿瘤免疫。CD123是LSCs的重要靶点，但单用抗CD123 MAb效果有限。BCG HSP70作为免疫优势抗原可增强白血病细胞免疫原性，打破免疫耐受。本研究构建的HSP70-MAb偶联物兼具靶向结合和免疫增强双重机制：抗CD123 MAb特异性结合CD123⁺ LSCs和MRD细胞，将BCG HSP70递送至肿瘤微环境；BCG HSP70增强免疫原性，触发特异性抗肿瘤T细胞应答。该偶联物在体外促进T细胞增殖和IFN-γ分泌，增强CTL杀伤；在体内抑制肿瘤生长，诱导Th1细胞生成和CD8⁺ T细胞浸润，导致肿瘤坏死。其效果优于单独使用抗CD123 MAb或BCG。研究局限性包括仅在细胞系和裸鼠模型验证，需在灵长类动物和临床试验中进一步评估安全性及机制。

**研究结论**（翻译自原文Conclusion部分）：
“总之，研究人员成功构建了BCG HSP70/抗CD123 MAb免疫偶联物，该偶联物保留了抗CD123 MAb的特异性抗原结合活性以及BCG HSP70的免疫增强活性。该免疫偶联物通过增强白血病细胞的免疫原性并触发特异性抗肿瘤T细胞免疫应答，在体外和体内发挥强效靶向抗白血病作用。这种新型免疫偶联物作为治疗儿童AML（尤其是难治/复发性病例）的治疗药物具有巨大的临床潜力，并为AML的靶向免疫治疗提供了新思路。”