来自Vitex madiensis (Oliv.)的植物蜕皮甾酮的抗氧化与抗炎活性

《Molecules》：Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Phytoecdysteroids from Vitex madiensis (Oliv.)

　　

Vitex madiensis Oliv.（唇形科）是一种生长在全球热带和亚热带地区的物种。在几个非洲国家，该植物的不同器官——叶、果实、茎皮和根——被用于民间医学治疗头痛、牙痛、疼痛等。在本研究中，研究人员使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）研究了Vitex madiensis叶提取物的植物化学特征。通过活性氧（ROSs）生成试验和环氧合酶-2（COX-2）抑制试验评估了粗提物、馏分和纯分子的抗氧化和抗炎潜力。进行了生物活性导向的分离以鉴定最活跃的馏分，并从正丁醇馏分中分离出四种植物蜕皮甾酮：20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone）、ajugasterone C、vitexirone和pterosterone。20-羟基蜕皮酮显示出非常好的抗炎特性，与对照组相比，在脂多糖（LPS）刺激的人血白细胞中使COX-2表达显著降低超过70%。本研究证实了植物蜕皮甾酮的治疗潜力。

### 论文解读：Vitex madiensis叶中植物蜕皮甾酮的抗氧化与抗炎活性

**研究背景与目的**
Vitex属植物（唇形科）全球约有270个物种，多分布于热带地区，其中110种在非洲被用于传统医学。Vitex madiensis Oliv.是一种灌木，其叶、果实、茎皮和根在非洲民间被用于治疗发热、疟疾、失眠、疼痛和炎症。已有研究报道其提取物具有抗蠕虫、降血糖、抗高血糖和抗菌活性。尽管一些Vitex物种（如V. negundo、V. rotundifolia、V. agnus-castus）的化学成分已被较好描述，但V. madiensis的化学组成尚不明确。已有研究显示该植物含有类黄酮、环烯醚萜、酚酸及其衍生物以及植物蜕皮甾酮。植物蜕皮甾酮属于类固醇激素家族，最初从节肢动物中分离，在蜕皮、发育和繁殖中起关键作用；在植物中，它们参与防御无脊椎动物捕食。已有许多研究证明其具有抗糖尿病、抗应激、解痉和抗炎等多种治疗活性，并能减少阿尔茨海默病患者脑中淀粉样斑块的形成。此前对V. madiensis四个部位（叶、树干皮、根皮、果实）的植物化学分析显示，各部分均含有20-羟基蜕皮酮、vitexirone和ajugasterone C等植物蜕皮甾酮，其中叶的甲醇提取物表现出最佳的自由基清除（DPPH）和活性氧（ROS）抑制活性。因此，本研究旨在通过生物活性导向分离，确定甲醇提取物中哪些代谢物负责抗氧化和抗炎活性，并评估它们对脂多糖（LPS）刺激的人血白细胞中COX-2表达的影响。论文发表在《Molecules》。

**关键技术方法**
研究人员采集了V. madiensis叶片（来源：刚果布拉柴维尔南部热带草原，标本保藏于IRSEN，编号T7041），干燥研磨后甲醇浸提获得粗提物。通过液液分级萃取（依次用环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水）得到5个馏分。采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）进行植物化学分析，使用C18反相色谱柱，以甲酸水-甲酸乙腈为流动相梯度洗脱，结合高分辨质谱（Orbitrap）鉴定化合物。抗氧化活性通过二氢罗丹明123（DHR123）荧光法检测人血白细胞（来源：法国血库EFS克莱蒙费朗的健康志愿者，n=6，知情同意）中ROS生成抑制；抗炎活性通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测COX-2基因表达。活性最强的丁醇馏分采用反相闪式色谱（C18柱，水-乙腈80:20）和制备型高效液相色谱（HPLC）进一步分离纯化得到纯化合物，并通过核磁共振（NMR）和质谱确认结构。

**研究结果**

**2.1 生物活性导向分离**
对甲醇粗提物进行液液萃取得到5个馏分：E1-cyclo（环己烷，27%）、E2-DCM（二氯甲烷，3.5%）、E3-AcOEt（乙酸乙酯，8.5%）、E4-BuOH（正丁醇，28%）和E5-H₂O（水，27%）。通过LC-MS分析各馏分化学组成，并评估其抑制ROS生成的活性。

**2.2 植物化学图谱**
E1-cyclo和E2-DCM富含非极性化合物（如十八碳烯二酸、二甲氧基槲皮素和木犀草素）。E3-AcOEt和E4-BuOH主要含有五种潜在的蜕皮甾酮（20-羟基蜕皮酮、ajugasterone C、vitexirone、isovitexirone和pterosterone），以及糖基化黄酮（木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、荭草苷）和咖啡酰奎宁酸衍生物。E5-H₂O主要含糖类、有机酸和少量蜕皮甾酮。

**2.3 抗氧化与抗炎活性**
在浓度0~100 μg/mL范围内，甲醇粗提物在25 μg/mL时显著抑制ROS生成（约45%抑制），50 μg/mL及以上抑制超过50%。E1-cyclo、E3-AcOEt和E4-BuOH三个馏分在25 μg/mL及以上浓度也显著降低ROS生成（分别达?57%、?62%和?50%），其中E3-AcOEt在最低浓度10 μg/mL即显示47%抑制。基于此，研究人员选择活性强且产量最高的E4-BuOH馏分进行进一步分离。

**2.4 植物蜕皮甾酮的分离与抗氧化活性**

**2.4.1 分离与鉴定**
E4-BuOH馏分经反相闪式色谱纯化得到8个亚馏分，从中分离出20-羟基蜕皮酮1（42 mg）和ajugasterone C 2（21 mg）。剩余馏分合并后再次经反相闪式色谱和制备型HPLC获得vitexirone 3（6 mg）和pterosterone 4（3 mg）。四种化合物的结构均通过NMR（¹H、¹³C）和HRESIMS确认，数据与文献一致。

**2.4.2 抗氧化活性**
在1~25 μM浓度下测试了化合物1、2、3（pterosterone因量少未测）对PMA刺激的白细胞ROS生成的影响。结果显示，ajugasterone C在10 μM时使ROS降低31%（p<0.01），vitexirone在10 μM时降低24%（p<0.05），而20-羟基蜕皮酮从1 μM起即显著降低至少37%，且呈剂量依赖性。所有化合物在2小时内对白细胞活力无显著影响（刀天青法验证，无统计学差异）。

**2.5 20-羟基蜕皮酮的抗炎潜力**
以20-羟基蜕皮酮（1 μM）处理LPS（10 μg/mL）刺激的白细胞4小时，通过RT-qPCR检测COX-2基因表达。与对照组（仅LPS刺激）相比，20-羟基蜕皮酮使COX-2相对表达显著降低超过70%（p≤0.01）。该结果表明20-羟基蜕皮酮通过抑制COX-2表达发挥抗炎作用，可能涉及花生四烯酸通路，但具体分子靶点需进一步研究。

**讨论与结论**
研究讨论指出，20-羟基蜕皮酮显著降低COX-2基因表达，提示其可能通过下调前列腺素合成发挥抗炎作用，与文献报道的ajugasterone C在大鼠足肿胀模型中的抗炎效应以及20-羟基蜕皮酮在多种细胞系中的抗氧化抗炎结果一致。在COVID-19大流行背景下，20-羟基蜕皮酮曾被用于开发改善严重肺炎患者呼吸功能的药物（利用其抗炎、抗血栓和抗纤维化特性）。本研究结果进一步确认了植物蜕皮甾酮的治疗潜力。

论文结论翻译如下：对Vitex madiensis叶甲醇提取物的生物活性导向分离揭示了活性馏分中存在植物蜕皮甾酮，这些是Vitex属的分类学标志物。因此，研究人员从丁醇馏分中分离并鉴定了四种植物蜕皮甾酮：20-羟基蜕皮酮、ajugasterone C、vitexirone和pterosterone。评估了化合物1、2和3的抗氧化活性，结果显示在存在这三种化合物的情况下孵育2小时后，白细胞ROS生成显著减少。此外，20-羟基蜕皮酮表现出更强的剂量依赖性抑制。获得的结果更有趣的是，这些化合物均未表现出对细胞活力的细胞毒性作用。通过实时定量PCR（qPCR）研究了20-羟基蜕皮酮对COX-2基因表达的抗炎潜力。该化合物显示出非常好的抗炎潜力，与对照组相比，细胞中COX-2相对表达显著降低超过70%。获得的结果证实了植物蜕皮甾酮具有有趣的抗炎特性，这可能证明传统治疗师使用Vitex madiensis治疗涉及炎症过程的疾病的实践是合理的。然而，通过额外分析20-羟基蜕皮酮对花生四烯酸途径（COX-1和促炎前列腺素PGE₂）或促炎/抗炎细胞因子分泌的活性，并探索其作用机制，来完善这些结果将是有意义的。