《Antibiotics》：Trends and Long-Term Mortality in Sepsis: Evidence from a Population-Based Retrospective Cohort Study of 13,994 Hospitalizations in the Abruzzo Region, Central Italy
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结核病（tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)引起的重大全球健康挑战。近期，D-型人乳铁蛋白肽1–11 (D-form human lactoferricin
结核病（tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)引起的重大全球健康挑战。近期，D-型人乳铁蛋白肽1–11 (D-form human lactoferricin 1–11, D-form hLF 1–11)，一种源自乳铁蛋白N端区域的短肽，展现出强效的抗分枝杆菌活性，但其直接作用机制尚未阐明。在本研究中，研究人员以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为模式生物探究D-form hLF 1–11活性的作用机制。首先，测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，结果显示在400 μg/mL浓度下可抑制细菌生长。活/死荧光染色证实了其杀分枝杆菌活性，表现为相对于未处理对照组碘化丙啶(propodium iodide, PI)摄取量增加。扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和高分辨荧光显微镜揭示膜破坏及显著的形态变形，同时观察到肽在膜上及细胞内呈时间依赖性积累。此外，对肽处理细胞进行无标记定量蛋白质组学分析发现，碳代谢、乙酰辅酶A依赖性脂质生物合成、氧化应激防御、翻译系统及能量产生系统发生广泛代谢改变。综上所述，这些发现为D-form hLF 1–11抗耻垢分枝杆菌的抗菌活性机制提供了深入见解。
结核病作为由结核分枝杆菌复合群引起的传染性疾病，仍是全球范围内导致死亡的主要传染病之一。世界卫生组织数据显示，2024年全球约有1070万人罹患结核病，约123万人死于结核病相关疾病。标准抗结核治疗方案需联合用药，异烟肼和利福平作为一线抗结核药物对药物敏感菌株具有良好疗效，但存在疗程长、肉芽肿病灶渗透性差及多种不良反应等问题。此外，不规范或不完整的治疗加速了耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的出现与传播，亟需开发新型治疗药物。抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)作为对抗感染性疾病的一类有前景的治疗药物应运而生，但因其易被内源性蛋白水解酶降解而半衰期短，临床应用受限。以D-型对映体肽替代可显著提高生物环境中的稳定性，增强对蛋白酶介导切割的抗性，延长系统存留时间，减少给药频率，提升治疗适用性。
人乳铁蛋白肽1–11 (hLF 1–11)是从铁结合糖蛋白乳铁蛋白N端区域衍生的11个氨基酸残基短肽，具有广谱抗菌活性。近期，研究人员实验室已证实D-form hLF 1–11对药物敏感型和耐药型结核分枝杆菌，以及非结核分枝杆菌如鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌均具有抗分枝杆菌活性，但其直接作用机制尚不明确。鉴于耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌具有显著的遗传和表型相似性，本研究采用该快速生长非致病性菌种作为模式生物，通过刃天青微孔板实验(resazurin microplate assay, REMA)测定D-form hLF 1–11的最低抑菌浓度，利用活/死荧光染色和时间-杀菌动力学实验评估其杀菌活性，采用扫描电子显微镜观察结构形态变化，运用高分辨率荧光显微镜可视化肽在细菌细胞内的定位，最后通过无标记定量蛋白质组学分析探究耻垢分枝杆菌对D-form hLF 1–11的细胞应答。
在本研究中，研究人员开展了一系列实验以阐明D-form hLF 1–11的抗分枝杆菌机制。首先，依据临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)指南测定最低抑菌浓度，结果显示D-form hLF 1–11对耻垢分枝杆菌ATCC 14468的最低抑菌浓度为400 μg/mL，与先前报道的抗结核肽AK 15-6相当，莫西沙星作为阳性对照其最低抑菌浓度在可接受范围内（≤1 μg/mL）。活/死荧光共染色实验采用SYTO 9/PI双荧光染色评估杀菌活性，结果显示D-form hLF 1–11处理组的PI荧光强度在细胞数量和荧光强度两方面均显著高于未处理对照，表明细胞膜完整性受损。时间-杀菌曲线显示，D-form hLF 1–11在0至1600 μg/mL浓度范围内呈剂量依赖性生长抑制，≥400 μg/mL浓度可完全抑制耻垢分枝杆菌生长，据此确定蛋白质组学分析的最佳抑制条件为400 μg/mL处理20小时。
扫描电子显微镜分析显示，未处理对照细胞呈边界清晰、笔直细长杆菌形态，表面光滑完整；而400 μg/mL（1×最低抑菌浓度）和800 μg/mL（2×最低抑菌浓度）处理后，细胞出现明显形态改变，包括扭曲变形、明显的细胞融合以及小球形结构的存在。高分辨率荧光显微镜肽定位实验采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的D-form hLF 1–11进行三色荧光标记，早期时间点肽主要定位于细菌表面，随孵育时间延长，肽在膜上及细胞内积累增加，同时PI摄取和核酸染色增强，提示D-form hLF 1–11以时间依赖性方式破坏耻垢分枝杆菌膜完整性。
蛋白质组学分析方面，研究人员采用碳酸氢铵缓冲液提取细胞总蛋白，D-form hLF 1–11处理组蛋白浓度（均值0.206 mg/mL）低于未处理对照组（均值0.510 mg/mL），因此在进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析前将蛋白浓度调整至等光密度。热图分析显示处理组与对照组蛋白谱差异显著，在检测到的223个蛋白组中，火山图分析鉴定出38个显著差异蛋白（p值<0.05）。蛋白质-蛋白质-化学物质相互作用(protein-protein-chemical interaction, PPCI)网络分析显示，处理组中上调蛋白主要涉及糖酵解、糖异生、氮代谢、氧化型三羧酸循环和脂质代谢，包括3-磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶（NADP依赖性）、延胡索酸水合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等；而下调蛋白主要与翻译、蛋白质折叠和能量产生相关，包括多个核糖体小亚基蛋白（rpsG、rpsQ、rpsH、rpsR2、rpsS、rpsT）、核糖体大亚基蛋白（rplV、rplB、rplW、rplM、rplE）、延伸因子Tu、ATP合酶亚基、分子伴侣及多种代谢酶。其中，二烯内酯水解酶和转录调控蛋白PdtaR上调倍数分别约为120倍和32000倍，提示代谢适应以支持能量产生和生物量维持。
讨论部分，研究人员首先阐述了研究的必要性：尽管已有研究证实D-form hLF 1–11的宿主定向免疫调节机制，但其直接抗分枝杆菌机制尚不清楚。耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌共享超过2800个同源蛋白编码基因，是研究分枝杆菌生理学、药物敏感性及作用机制的理想模式生物。值得注意的是，D-form hLF 1–11对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度显著低于耻垢分枝杆菌，这种差异敏感性可能归因于菌种间细胞包膜、脂质组成和膜通透性的差异。在安全性方面，既往数据显示D-form hLF 1–11即使浓度高达4000 μg/mL仍无溶血活性，且负载于诺昔脂(niosomes)后对肺泡巨噬细胞无细胞毒性，本研究进一步证实其对A549人肺泡上皮细胞系无细胞毒性。
关于作用机制，扫描电子显微镜和荧光成像结果支持膜扰动和可能的肽跨膜转运。生物物理分析表明hLF 1–11与膜模拟环境相互作用，可特异性结合革兰氏阴性菌脂多糖的脂质A部分，并能与双链DNA结合，提示其可能跨细胞质膜与胞内DNA相互作用。蛋白质组学分析揭示的代谢改变包括：中央碳代谢增强以满足升高的能量需求、乙酰辅酶A依赖性脂质代谢重塑以支持膜修复、醛脱毒和氧化还原调控、氧化应激防御途径激活（如过氧化氢-过氧化物酶KatG2诱导）、氮代谢与氨基酸生物合成调控，以及全局生物合成活性抑制。二烯内酯水解酶参与芳香族化合物降解生成的反应性中间体解毒，PdtaR作为双组分调控系统组分在营养限制时调控中央碳代谢和生物合成途径。
研究结论指出，D-form hLF 1–11通过膜破坏和可能的胞内干扰发挥抗分枝杆菌活性，但M. smegmatis与M. tuberculosis在致病性和毒力相关基因方面存在实质差异，未来需进一步评估D-form hLF 1–11穿透宿主细胞膜、到达胞内区室如吞噬体并在感染细胞及动物模型中的抗分枝杆菌活性，以确定其对结核分枝杆菌包括耐药菌株的治疗潜力。
