摘要
背景/目标：自我放大RNA（saRNA）载体能够以极低的初始剂量实现高效的外源基因表达。尽管基于阿尔法病毒的saRNA系统被广泛使用，但它们存在诸多缺陷，包括基因组体积过大、复制酶结构复杂以及细胞毒性较强。诺达玛拉病毒（NoV）因其紧凑的基因组（3.2 kb）和较低的细胞毒性而成为一种有潜力的替代选择。本研究旨在阐明NoV RNA1的复制机制，并开发一种新型的基于NoV的saRNA载体平台。方法：我们建立了毕赤酵母系统来研究NoV RNA1的复制过程以及蛋白A的定位情况。通过构建N端缺失突变体以及靶向内质网的嵌合体，分析了决定蛋白质膜定位的关键因素。基于对这些机制的理解，我们在亚基因组RNA3区域的RNA3422位点插入外源基因，从而开发出了NovaVec载体。在BALB/c小鼠中，我们使用脂质纳米颗粒包裹的NovaVec载体来表达纳米荧光素酶或猴痘A33R抗原，以此评估其在体内的表现。结果：我们发现NoV蛋白A中存在两个冗余的线粒体定位域（氨基酸2-15和16-33），其中任意一个定位域都足以实现蛋白质的正确定位和复制。该复制机制可以被重新定向至内质网，同时仍保持复制功能。脂质纳米颗粒包裹的NovaVec载体能够在小鼠体内持续表达外源基因长达54天，这一表现远远优于14天内就会失去表达信号的传统mRNA载体。基于NovaVec的猴痘A33R疫苗在加强免疫后能够引发强烈的抗原特异性体液免疫反应，抗体滴度可达到约1:12,800。结论：由于拥有仅编码单一复制酶蛋白的紧凑基因组、较低的细胞毒性，以及出色的长期蛋白质表达能力，NovaVec有望成为下一代用于疫苗研发的saRNA载体平台。
