描述铜绿假单胞菌中导致齐德巴坦耐药的V516M青霉素结合蛋白2（PBP2）突变

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Characterizing the V516M penicillin-binding protein 2 (PBP2) mutation causing zidebactam resistance in Pseudomonas aeruginosa

　　

双环硼酸酯类（DBO）齐德巴坦的三重作用（抗菌活性[青霉素结合蛋白2 {PBP2}抑制剂]、β-内酰胺增强[与PBP3抑制剂的协同作用]和β-内酰胺酶抑制[A类和C类]）为克服铜绿假单胞菌耐药性提供了有前景的方法。然而，PBP2突变（特别是V516M）与耐药性相关。因此，研究人员使用PBP2^V516M突变体以及与dacB、mexR、mexZ或oprM敲除突变的组合，表征了PBP2^V516M突变对一组β-内酰胺类和DBO的活性及PBP结合亲和力（50%抑制浓度[IC₅₀s]）的影响。V516M显著增加了齐德巴坦的最低抑菌浓度（MIC）和PBP2的IC₅₀，并决定了β-内酰胺类和DBO易感性和PBP结合谱的特异性模式。纳库巴坦与齐德巴坦显示交叉耐药，但其对PBP2的基础结合亲和力低得多，解释了其较低的内在抗假单胞菌活性。相反，杜洛巴坦与齐德巴坦无交叉耐药，与其主要靶标是PBP1b而非PBP2一致；杜洛巴坦的低内在活性与外排有关。同样，美西林的PBP2结合与齐德巴坦相似，但其较低的抗假单胞菌活性与外排（MexAB-OprM）的较高贡献有关。相比之下，亚胺培南几乎不受PBP2^V516M突变影响。齐德巴坦耐药不影响其作为AmpC抑制剂的活性，在dacB突变体中恢复头孢吡肟易感性。PBP2^V516M突变与细胞形态变化相关，但不影响生长速率或毒力。PBP2^V516M突变的抗生素耐药性和PBP IC₅₀谱有助于理解靶标修饰耐药机制对现有DBO的影响，并为指导新型衍生物的开发提供线索。

**论文解读：铜绿假单胞菌PBP2 V516M突变致齐德巴坦耐药机制研究**

**研究背景与问题**

铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）是一种普遍存在的机会性病原体，被视为抗菌药物耐药的典范，是医院获得性和慢性感染的主要原因，具有高发病率和死亡率。碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌被世界卫生组织（WHO）列为新抗生素研发的关键优先级别。耐药性源于菌株通过染色体突变产生耐药的能力、可转移耐药决定簇（如碳青霉烯酶）的流行以及多重耐药/广泛耐药（MDR/XDR）流行谱系（即高风险克隆）的全球传播。近年来虽引入多种新型β-内酰胺类及β-内酰胺酶抑制剂组合（如头孢洛扎/他唑巴坦、头孢他啶/阿维巴坦等），但耐药机制不断涌现。

齐德巴坦（zidebactam）是首个描述的双环硼酸酯类（DBO）革兰阴性菌β-内酰胺增强剂，具有独立的抗假单胞菌活性。其与头孢吡肟（cefepime）的复方制剂正在临床开发中，用于治疗MDR/XDR革兰阴性菌感染。齐德巴坦通过三重作用（直接抗菌活性、β-内酰胺增强活性、A类和C类β-内酰胺酶抑制）克服铜绿假单胞菌耐药机制，但体外已筛选出特定PBP2突变（尤其V516M）导致耐药。深入研究该突变对β-内酰胺类及DBO药物活性和PBP结合的影响，对于理解靶标修饰耐药机制及指导新药开发至关重要。

**研究内容与结论**

研究人员利用同源重组法构建了PAO1菌株的PBP2^V516M等基因突变体，并进一步结合dacB（AmpC过表达相关）、mexR（MexAB-OprM外排泵调控）、mexZ（MexXY-OprM外排泵调控）或oprM（外排孔蛋白）敲除突变，系统评估了该突变对多种β-内酰胺类和DBO药物的最低抑菌浓度（MIC）及PBP结合亲和力（IC₅₀）的影响。同时检测了突变体的PBP2表达水平、细胞形态、生长速率及毒力（采用秀丽隐杆线虫和蜡螟幼虫感染模型）。结果表明，PBP2^V516M突变显著提高齐德巴坦的MIC（从4 μg/mL升至128 μg/mL）和PBP2的IC₅₀（从0.063 μg/mL升至>128 μg/mL），并决定β-内酰胺类和DBO易感性的特异性模式。该研究为理解靶点修饰耐药机制提供了关键数据，论文发表在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》。

**主要关键技术方法**

1. **同源重组法构建突变体**：利用pEX18GmR质粒和Cre-lox系统构建PAO1的PBP2^V516M单突变体及与dacB、mexR、mexZ、oprM的组合敲除突变体，经Sanger和全基因组测序验证。
2. **微量肉汤稀释法测定MIC**：根据EUCAST指南，测定头孢吡肟、亚胺培南、齐德巴坦、头孢吡肟/齐德巴坦（1:1）、纳库巴坦、杜洛巴坦、美西林、瑞莱巴坦和阿维巴坦的MIC，重复三次。
3. **实时定量RT-PCR**：测定pbpA基因的mRNA表达水平，以rpsL为内参。
4. **PBP结合试验**：从对数晚期PAO1及PBP2^V516M突变体制备膜蛋白，与不同浓度药物孵育后，用BOCILLIN FL荧光青霉素标记，通过SDS-PAGE和成像系统定量IC₅₀。
5. **感染模型**：采用秀丽隐杆线虫（*Caenorhabditis elegans*）杀伤试验和蜡螟（*Galleria mellonella*）感染模型评估毒力。

**研究结果**

**1. PBP2^V516M突变对抗菌药物易感性的影响**
通过MIC测定发现，V516M突变导致齐德巴坦MIC从4 μg/mL升至128 μg/mL；纳库巴坦MIC显著增加，而杜洛巴坦MIC不变。头孢吡肟MIC不受显著影响，但头孢吡肟/齐德巴坦复方MIC略有升高；亚胺培南MIC仅升高1个二倍稀释度；美西林MIC显著升高。在组合突变中，齐德巴坦在PBP2^V516M-dacB突变体中恢复头孢吡肟MIC，提示齐德巴坦的AmpC抑制活性不受影响；外排泵过表达（mexR、mexZ）稍升高齐德巴坦及复方MIC，而外排缺陷（oprM）降低MIC。杜洛巴坦的MIC受外排泵调节，纳库巴坦不受影响；头孢吡肟和美西林在oprM突变体中MIC显著降低，亚胺培南则不明显。

**2. PBP2^V516M突变对PBP结合亲和力的影响**
采用PBP结合试验测定IC₅₀，结果显示V516M突变导致齐德巴坦对PBP2的IC₅₀从0.063 μg/mL升至>128 μg/mL；分子对接揭示V516残基与齐德巴坦在PBP2催化中心的相互作用。美西林与齐德巴坦类似，IC₅₀从0.097 μg/mL升至>128 μg/mL，确认两者特异性结合PBP2。亚胺培南对所有PBP结合有效，PBP2 IC₅₀无显著差异（0.046 vs 0.038 μg/mL）。纳库巴坦行为类似齐德巴坦，但基础IC₅₀较高（2.5 μg/mL），在突变体中升至>128 μg/mL，解释其较低的抗假单胞菌活性。杜洛巴坦在野生型中最高亲和力为PBP1b（0.02 μg/mL），PBP2为0.57 μg/mL，突变体PBP2 IC₅₀升高但不剧烈，提示其抗假单胞菌活性主要依赖PBP1b，故与齐德巴坦无交叉耐药。

**3. PBP2^V516M突变对细胞形态、生长速率和毒力的影响**
PBP结合谱显示PBP2^V516M突变体的PBP2表达量降低（相对PBP3归一化强度为0.36 ± 0.10），但pbpA基因mRNA表达未改变，排除转录调控；全基因组测序未发现其他次级突变。显微形态观察发现突变体细胞更圆，提示PBP2功能部分缺陷。然而，生长曲线（CFU/mL和OD₆₀₀）及两种无脊椎动物模型（秀丽隐杆线虫和蜡螟）的毒力试验均未显示显著差异，表明该突变不影响生长速率和毒力。

**总结与讨论**

研究人员通过系统表征PBP2^V516M突变在铜绿假单胞菌中的作用，证实该突变导致齐德巴坦高度耐药（MIC和PBP2 IC₅₀显著升高），并赋予特定β-内酰胺类和DBO易感性谱。纳库巴坦与齐德巴坦存在交叉耐药，但基础亲和力低；杜洛巴坦因主要靶标为PBP1b而避开交叉耐药。美西林虽与齐德巴坦共享PBP2结合，但其低抗假单胞菌活性主要源于外排泵（MexAB-OprM）的贡献。亚胺培南因广谱PBP结合而几乎不受影响。齐德巴坦的AmpC抑制活性在突变体中保持完好。突变导致细胞形态变圆但不影响生长和毒力，提示该突变可能在体内被选择，但临床分离株中罕见；已有报道在产碳青霉烯酶大肠杆菌中出现近缘替代（V517M）。体外进化实验还显示PBP2突变可与PBP3突变联合导致高适应性代价，而首个临床治疗耐药案例仅涉及外排泵。因此，PBP2突变（包括V516M）的临床意义仍需通过治疗患者监测加以证实。总体而言，该研究深入分析了PBP结合谱和靶点突变，为开发非β-内酰胺PBP抑制剂（可伴或不伴β-内酰胺酶抑制活性）治疗MDR革兰阴性菌感染提供了重要信息。

**研究结论翻译**：
总体而言，从更广阔的视角，研究人员的研究深入分析了PBP结合谱和靶点突变，为当前对一系列不同非β-内酰胺PBP抑制剂（伴或不伴β-内酰胺酶抑制活性）用于治疗MDR革兰阴性菌感染的兴趣重燃提供了有用信息，并推动了该领域向前发展。