BAS-1 的特征分析，一种由多形拟杆菌编码的新型 A 类 β-内酰胺酶

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Characterization of BAS-1, a novel class A β-lactamase encoded in Bacteroides thetaiotaomicron

　　

研究人员在一株对 β-内酰胺类全部耐药的多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）临床分离株中鉴定了一种新型 A 类 β-内酰胺酶（BAS-1）。全基因组测序发现 bla_BAS-1 位于一个与 IS4351 相关的可移动遗传元件内。克隆、药敏试验、β-内酰胺灭活法（β-LIM）和半抑制浓度（IC₅₀）测定证实该酶对青霉素类、头孢菌素类、单环 β-内酰胺类产生耐药，并对 β-内酰胺酶抑制剂的敏感性降低。迄今为止，尚未有来自拟杆菌属（Bacteroides）的 A 类 β-内酰胺酶表现出如此耐药谱，这对 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂联合用药的假定可靠性提出了挑战。

**论文解读文章**

**研究背景**
拟杆菌属（Bacteroides spp.）作为肠道菌群核心成员和条件致病菌，已被公认为抗菌药物耐药基因的储存库。针对厌氧菌感染的一线疗法（包括甲硝唑、哌拉西林-他唑巴坦及美罗培南）中，由于过度使用，耐药性呈上升趋势，且近年在这些菌种中不断有新型耐药机制被报道。目前已知的拟杆菌属 β-内酰胺酶以 CfxA 等为主，但现有 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合在临床实践中仍被认为较为可靠。然而，本研究推测存在一种能瓦解这一假定的新型耐抑制剂 β-内酰胺酶。为此，研究人员从 Virgen del Rocío University Hospital 6 个月内收集的拟杆菌属分离株中，鉴定了来自一名 74 岁男性腹腔脓肿的泛 β-内酰胺耐药多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）临床分离株 BT736，该患者在住院期间曾接受阿莫西林/克拉维酸治疗，从而为探索新型耐药机制提供了样本来源。

**主要关键技术方法**
研究人员采用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）进行全基因组测序，借助 BLASTp 对 NCBI 和 β-内酰胺酶数据库进行序列比对，并通过交互式生命树工具（Interactive Tree of Life）基于代表性 A 类 β-内酰胺酶氨基酸序列构建系统发育树。为评估表型贡献，利用 Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒将 bla_BAS-1 克隆至 pTOPO 质粒并在大肠杆菌 TOP10 中表达，通过肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。为区分 CfxA 与 BAS-1 的耐药作用，开展了 β-内酰胺灭活法（β-LIM）并使用克拉维酸、他唑巴坦和阿维巴坦进行半抑制浓度（IC₅₀）测定（以 CENTA 为底物），同时通过 RT-qPCR 定量 cfxA2 和 bla_BAS-1 的相对表达水平（以 16S rRNA 为内参，采用 2^?ΔΔCT 法分析）。

**研究成果**
**鉴定和基因组分析**
通过全基因组测序，BT736 携带 tet(X)、tet(Q)、erm(F) 及 cfxA 等已知耐药基因，但仅 CfxA 一种 β-内酰胺酶无法解释其对碳青霉烯类和 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的耐药表型。经降低覆盖度和一致性阈值重新分析，发现一个编码新型 A 类 β-内酰胺酶（命名为 BAS-1）的开放阅读框。BLASTp 显示其与 MUN-1 的氨基酸一致性为 64%（覆盖度 100%），与拟杆菌属部分蛋白序列一致性为 100%（覆盖度 71%），与 Candidatus Cryptobacteroides avistercoris 中一个蛋白一致性为 91.13%（覆盖度 98%），支持 BAS-1 属独立酶而非已知酶变体。系统发育树分析表明，BAS-1 与来自拟杆菌属的 CfxA、MUN-1、CblA-1、CepA 及 PbbA 等酶聚为一簇，且结构上保留 A 类 β-内酰胺酶三个保守基序（SVFK、SDN 和 KTGS）。基因环境分析发现 bla_BAS-1 位于一个 10724 bp 的可移动遗传元件内，其上游紧邻 IS4351 插入序列，该元件在基因组中出现于两个不同位置，提示 IS4351 可能通过增强表达参与 BAS-1 的调控和转座。

**克隆、药敏试验及抑制剂耐药性**
将 bla_BAS-1 克隆至大肠杆菌 TOP10 后，MIC 测定显示相较对照菌株，对青霉素类（氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林 MIC >256 mg/L）、头孢菌素类（头孢呋辛、头孢他啶、头孢噻肟、头孢洛林等 MIC 升高）和单环 β-内酰胺类（氨曲南 MIC >256 mg/L）产生耐药，且阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶-阿维巴坦的 MIC 未恢复或未改变，表明 BAS-1 对 β-内酰胺类及其抑制剂均具抵抗性。但与 BT736 野生型表型不完全一致，研究人员归因于属间启动子（拟杆菌 ?7/?33 与大肠杆菌 ?10/?35）和核糖体结合位点差异及翻译后修饰需要。

**β-LIM 和半抑制浓度测定**
为区分 CfxA 与 BAS-1 对抑制剂耐药性的贡献，以 BT162（仅携带 cfxA2）为对照，β-LIM 结果显示所有抑制剂存在下 BT736 均呈阳性（水解），而 BT162 则产生与无菌对照相当的抑菌圈，提示 CfxA2 受抑制剂抑制而 BAS-1 呈广谱抑制剂耐药。RT-qPCR 证明 BT736 中 cfxA2 表达水平低于 BT162，排除了 CfxA2 高表达导致抑制剂耐药的假说。进一步用 BAS-1 克隆株粗提物测定 IC₅₀，克拉维酸、他唑巴坦和阿维巴坦的 IC₅₀ 均接近 1 μM，表明 BAS-1 比 TEM、CTX-M、SHV、VEB、BEL 等酶更耐抑制剂，但比 GES-5、GES-6、KPC 和 PER 酶更敏感。这些结果提示 BT736 临床分离株对 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的耐药表型可能是 BAS-1 与菌株通透性下降的共同作用。

**总结讨论**
研究结果表明，在拟杆菌属中鉴定出一种新型可移动 A 类 β-内酰胺酶，其编码基因位于与 IS4351 相关的可移动元件上，该酶不仅水解多种 β-内酰胺类，还显著降低 β-内酰胺酶抑制剂的效力。这一发现挑战了目前用于厌氧菌感染一线治疗的 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的假定可靠性，提示此类组合在拟杆菌属高水平耐药菌株中可能失效。研究人员强调，需要持续的分子监测和抗菌药物管理计划以应对这类耐药机制的扩散。

**研究结论翻译**
在拟杆菌属（Bacteroides spp.）中发现一种新型可移动 A 类 β-内酰胺酶，具有重要的临床和流行病学意义。该酶由与 IS4351 相关的可移动元件编码，赋予 β-内酰胺类耐药并降低对 β-内酰胺酶抑制剂的敏感性，可能削弱当前用于厌氧菌感染一线治疗的 β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的可靠性。这些发现突显了持续监测、分子表征和抗菌药物管理的必要性。该论文发表在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》。