噬菌体来源的内溶素预防口腔与白色念珠菌共感染期间耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的播散

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Phage-derived endolysin prevents dissemination of methicillin resistant Staphylococcus aureus during oral co-infection with Candida albicans

　　

口腔被许多种细菌和真菌定殖，但通常不会引起宿主严重感染。然而，当稳态丧失时，其中一些定殖者有可能侵入宿主并引发危及生命的感染。真菌白色念珠菌（*Candida albicans*）和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是研究充分的例证。在免疫低下的小鼠中，这两种菌的口腔共定殖可导致金黄色葡萄球菌播散至全身，引起金黄色葡萄球菌菌血症（bacteremia）并最终导致脓毒症（sepsis）。在此描述的原理验证实验中，研究人员展示了一种创新的内溶素（endolysin）衍生嵌合蛋白XZ.700能够有效预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant *S. aureus*, MRSA）的播散。利用已建立的口腔共定殖小鼠模型，研究人员评估了将XZ.700添加至饮水中（随意饮用，*ad libitum*）及以凝胶制剂每日两次涂抹的效果。XZ.700未在治疗小鼠中引起任何不良反应，也未减少白色念珠菌的定殖。饮水中添加XZ.700完全阻断了共感染小鼠中可检测到的MRSA播散，并显著减轻了体重减轻。凝胶制剂显示出减少舌部MRSA定殖及向肾脏播散的趋势，但与安慰剂对照组相比无显著差异。综合来看，这些结果表明，在与白色念珠菌共感染期间，使用XZ.700选择性清除小鼠口腔中的MRSA可有效预防其播散。进一步的研究需明确XZ.700及相关化合物在高危患者中预防脓毒症的临床适用性。

研究背景：口腔由多种细菌和真菌定殖，在健康状态下宿主与微生物群维持稳态。白色念珠菌（*Candida albicans*）是常见的定殖真菌，作为条件致病菌，在稳态失衡时（如免疫低下、抗生素使用或衰老）可引起口腔念珠菌病（oropharyngeal candidiasis, OPC）。同时，白色念珠菌与金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）共定殖于多个宿主生态位，二者存在协同作用。研究发现，OPC期间白色念珠菌菌丝侵入黏膜时，黏附于菌丝的金黄色葡萄球菌可被吞噬细胞摄取并转运至颈淋巴结，进而通过血液循环播散至肾脏等器官，导致菌血症和脓毒症。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant *S. aureus*, MRSA）在护理机构中常见，且对多种抗生素耐药，而金黄色葡萄球菌黏附于白色念珠菌菌丝后会降低抗生素（如万古霉素）的疗效。因此，迫切需要开发非抗生素的预防策略。

研究内容：本研究旨在评估噬菌体来源的内溶素衍生嵌合蛋白XZ.700是否能在口腔共定殖小鼠模型中预防MRSA播散。研究人员首先在体外观察XZ.700对黏附于白色念珠菌菌丝的MRSA的裂解效果，随后在含人类唾液的复杂环境中测试其活性，最后在已建立的白色念珠菌与MRSA口腔共定殖小鼠模型中评估两种给药方式（饮水中连续给药和凝胶每日两次涂抹）的预防效果。结论：XZ.700可在体外迅速裂解黏附于白色念珠菌菌丝的MRSA及MRSA生物膜，唾液不抑制其裂解活性；在小鼠模型中，饮水中添加100 μg/mL XZ.700显著减少舌部MRSA定殖约2个对数单位，完全阻断MRSA向肾脏播散，并减轻体重下降；凝胶制剂虽显示降低播散趋势但未达统计学显著性。重要意义：该研究首次证明内溶素可有效预防OPC相关MRSA播散，为高危患者（如护理机构中患口腔念珠菌病者）提供了一种抗生素替代预防策略。论文发表在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》。

主要关键技术方法：研究使用了以下关键方法：（1）体外共培养系统与实时显微成像：利用Bioflux微流控系统构建白色念珠菌菌丝，引入表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的MRSA USA300-GFP株，观察XZ.700处理后的荧光消失以评价裂解效果；（2）裂解活性测定：在含不同浓度过滤人类唾液（来自一名志愿者，经ACT伦理委员会批准）的条件下，通过测量OD₆₀₀和荧光信号评估XZ.700对浮游MRSA的裂解活性；（3）小鼠口腔共定殖模型：使用雌性C57BL/6J小鼠（约9周龄，购自Janvier），通过饮水中添加氨苄青霉素抑制固有菌群、皮下注射醋酸可的松诱导免疫抑制，并先后用海藻酸钙拭子将白色念珠菌SC5314（1×10⁷细胞/mL）和MRSA（4×10⁷细胞/mL）置于舌下感染，建立共定殖模型。XZ.700通过饮水（25或100 μg/mL，每日更换两次）或凝胶（20 μL，每日两次口腔内涂抹）给药，通过菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）计数评估舌部和肾脏的定殖水平，以体重减轻作为脓毒症指标。

研究结果：

**XZ.700可清除黏附于白色念珠菌菌丝的GFP表达MRSA**
利用活细胞延时成像，研究人员发现XZ.700（25 μg/mL）处理7.5分钟内即引起黏附30分钟的GFP-MRSA完全消失，而万古霉素（4 μg/mL）处理无显著效果；XZ.700与万古霉素联合使用同样有效。该结果通过荧光强度半定量分析确认。

**XZ.700有效清除在白色念珠菌菌丝上形成的年轻MRSA生物膜**
将MRSA在菌丝表面培养3小时形成初始生物膜后，XZ.700处理同样导致GFP荧光丢失，表明其可裂解已成熟的黏附菌群，而万古霉素处理无效果。

**人类唾液不抑制XZ.700对浮游MRSA的裂解活性**
在不同浓度过滤人类唾液（100%、50%、25%）存在下，XZ.700在5分钟内对MRSA的裂解活性与无唾液对照无明显差异，且在25 μg/mL浓度时裂解活性最高；更高浓度（如500 μg/mL）反而活性降低，与前期研究一致。

**饮水中添加XZ.700预防共感染小鼠中MRSA播散并减轻疾病症状**
在口腔共定殖模型中，饮水中含100 μg/mL XZ.700组与未处理组相比，舌部MRSA定殖显著降低约2 log₁₀ CFU/组织（P<0.001），且所有小鼠肾脏均未检测到MRSA播散（0/7 vs 对照组6/7），体重减轻也显著减轻（P<0.05）。而25 μg/mL XZ.700组舌部MRSA定殖有降低趋势但未达显著。白色念珠菌定殖未受影响。此外，仅感染MRSA的单感染小鼠中，XZ.700同样显著减少了舌部MRSA定殖。

**凝胶制剂XZ.700对MRSA定殖和播散的影响**
每日两次涂抹凝胶（含25或100 μg/mL XZ.700）后，所有凝胶处理组（包括安慰剂）的舌部白色念珠菌和MRSA定殖均低于未处理对照组，但XZ.700组与安慰剂组之间无显著差异；肾脏播散方面，100 μg/mL XZ.700组7只小鼠中有5只未检出MRSA（安慰剂组3/7，对照组2/7），提示保护趋势，但统计不显著。研究人员认为凝胶处理可能因小鼠舔舐导致机械清除生物膜，且饮水组持续暴露更有效。

讨论总结：本研究首次证明内溶素XZ.700在口腔白色念珠菌-MRSA共感染模型中的预防潜力。XZ.700不干扰白色念珠菌定殖，且口服给药未观察到毒性或过敏反应。饮水给药持续有效减少了MRSA定殖并完全阻断播散，减轻了体重下降这一脓毒症临床指标。凝胶制剂效果不显著可能因暴露频率较低。研究结论：选择性清除口腔中的金黄色葡萄球菌可有效预防细菌播散，XZ.700及相关化合物需进一步研究以评估其在预防高危患者脓毒症中的临床适用性。