外毒素S和T对内化铜绿假单胞菌的个体贡献

《Infection and Immunity》：Individual contributions of exotoxins S and T on internalized P. aeruginosa

　　

摘要
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种高优先级病原体，对全球医疗保健造成重大负担。尽管常被视为胞外病原体，但铜绿假单胞菌也能在多种细胞类型（包括上皮细胞、杯状细胞和巨噬细胞）内以胞内形式存在。这一特性归因于其两种依赖III型分泌系统（T3SS）的外毒素——外毒素S（ExoS）和外毒素T（ExoT），它们能使促进吞噬作用的宿主蛋白失活。然而，对胞内细菌的研究表明，ExoS通过其ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）活性，矛盾地促进存活和复制，似乎压倒了其自身和ExoT的抗内化特性。在此，研究人员通过检测这两种外毒素各自的两个功能域活性如何影响上皮细胞入侵，来界定ExoS和ExoT的个体和联合贡献。通过体外生化分析，研究人员发现ExoS能够ADP-核糖基化ExoT及其共享的人类辅因子14-3-3。研究人员还发现ExoT自身ADP-核糖基化，意外地增强了其GTPase激活蛋白（GAP）活性。利用荧光显微镜，研究人员发现任一外毒素的GAP活性并不阻止内化事件，而是与更少的内化细菌进入快速胞质复制阶段相关。研究人员证明ExoS ADP-核糖基转移酶（ADP-ribosyltransferase）活性与囊泡逃逸和胞质复制呈正相关，并且来自胞外细菌的ExoS递送触发胞内T3SS^?亚群转变为T3SS⁺并逃出囊泡。总体而言，本研究强调了铜绿假单胞菌被低估的胞内能力，并阐明了ExoS和ExoT的酶学结构域如何决定该病原体的胞内定位。

**论文解读文章**

**研究背景**
铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）是一种高优先级的机会性病原体，常感染表皮、呼吸道和角膜等组织，对全球医疗造成重大负担。尽管通常被视为胞外病原体，但大量研究表明该菌能在上皮细胞、杯状细胞和巨噬细胞中存活并复制，形成胞内感染。这一能力与其III型分泌系统（T3SS）依赖的外毒素ExoS和ExoT密切相关。ExoS和ExoT均由N端GTPase激活蛋白（GAP）结构域和C端ADP-核糖基转移酶（ADPRT）结构域组成。此前研究普遍认为，GAP结构域通过破坏宿主细胞骨架发挥抗吞噬作用，而ADPRT结构域则通过ADP-核糖基化多种宿主蛋白促进胞内生存和复制。然而，ExoS矛盾地既能抑制吞噬又能促进胞内存活，且ExoT的GAP活性似乎被ExoS所遮盖，两者在功能上的协调机制尚不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在通过系统分析ExoS和ExoT各自功能域对上皮细胞入侵的个体和联合贡献，阐明两者如何共同决定铜绿假单胞菌的胞内定位。该研究发表于《Infection and Immunity》。

**关键技术方法**
本研究使用HeLa细胞系和原代人角膜上皮细胞（ATCC PCS-700-010）作为宿主细胞模型。关键技术方法包括：体外ADP-核糖基化分析（通过Western blot检测修饰后的分子量位移）、RhoA GTP酶活性测定（利用GTP-Glo试剂盒检测GTP消耗）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定ADP-核糖基化精氨酸位点、荧光显微镜时间延迟成像（采用双报告质粒pCG-P_exoS-mS，实现组成型绿色荧光蛋白GFP表达和T3SS诱导的mScarlet表达）以及免疫荧光染色检测单ADP-核糖基化。所有细菌突变株均以铜绿假单胞菌PAO1为亲本，通过等位交换构建染色体催化失活点突变。

**研究结果**
**（1）ExoS和ExoT在体外自身和交叉ADP-核糖基化**
通过体外生化反应和Western blot分析，研究人员发现ExoS和ExoT均可发生自身ADP-核糖基化，且ExoS的效率显著高于ExoT。共孵育ExoS和ExoT时，观察到ExoT的交叉修饰条带，表明ExoS可ADP-核糖基化ExoT。此外，首次发现ExoS可ADP-核糖基化它们共同的宿主辅因子14-3-3β。

**（2）ExoS对ExoT的ADP-核糖基化不改变GAP结构域活性**
通过RhoA GTP酶活性测定，研究人员发现自身ADP-核糖基化对ExoS和ExoT的GAP活性影响不同：ExoS的GAP活性下降，而ExoT的GAP活性显著增强。但ExoS介导的交叉ADP-核糖基化对ExoT的GAP活性无显著影响，表明该修饰并非调节ExoT GAP活性的主要机制。

**（3）鉴定ExoS、ExoT和14-3-3β中ADP-核糖基化的精氨酸靶点**
通过LC-MS/MS分析，研究人员在ExoS中鉴定出R81、R319、R322和R352为ADP-核糖基化位点，在ExoT中鉴定出R79、R90、R149和R327，在14-3-3β中鉴定出R20、R43和R62。这些位点涉及GAP结构域、ADPRT结构域以及辅因子的关键区域，可能影响蛋白质功能和相互作用。

**（4）仅表达GAP结构域的铜绿假单胞菌保留入侵能力**
通过荧光显微镜时间延迟成像，研究人员发现表达仅GAP结构域（ExoS GAP⁺或ExoT GAP⁺）的菌株仍能入侵HeLa细胞，但入侵后主要局限于细胞内囊泡中，且T3SS转录活性低（GFP⁺ T3SS^?状态），不进入快速胞质复制阶段。相比之下，仅表达ADPRT结构域的菌株（尤其是ExoS ADPRT⁺）能频繁逃出囊泡并启动T3SS转录和胞质复制。

**（5）ExoS ADPRT活性在驱动囊泡逃逸中起关键作用**
通过比较染色体催化失活突变株，研究人员发现仅失活ExoS ADPRT结构域即可显著增加T3SS^?囊泡滞留细菌的比例，同时降低T3SS⁺胞质复制频率。而失活ExoT的GAP或ADPRT结构域对胞内定位影响较小。表明ExoS ADPRT活性是驱动囊泡逃逸和胞质复制的核心因素。

**（6）胞外递送ExoS ADPRT促进胞内囊泡逃逸**
利用高感染复数（MOI 1000）抑制胞外细菌T3SS激活后，研究人员发现几乎所有胞内细菌均处于T3SS^?囊泡状态且难以逃逸。随后进行二次感染实验，将非荧光菌株递送活性ExoS ADPRT，可触发预先感染的荧光标记细菌从囊泡逃逸并转变为T3SS⁺进行胞质复制，表明胞外ExoS ADPRT能调控胞内细菌的定位。

**（7）T3SS装置的产生对于最佳囊泡逃逸很重要**
二次感染ΔexsA（T3SS缺失）突变体时，ExoS ADPRT仅能部分促进其囊泡逃逸，效率远低于T3SS感受态菌株。提示完整的T3SS装置（而非仅效应器）是细菌从囊泡中高效逃逸的必要条件。

**（8）效应器影响原代人角膜上皮细胞中的细菌运输**
在原代人角膜上皮细胞中重复关键实验，趋势与HeLa细胞一致：野生型PAO1和ΔexoSTY突变体存在T3SS⁺胞质复制，而ΔexsA突变体主要限于囊泡。GAP⁺菌株倾向于T3SS^?囊泡滞留，ADPRT⁺菌株则促进胞质复制，验证了效应器功能域的保守作用。

**总结讨论**
研究进一步揭示了控制铜绿假单胞菌胞内定位的分子机制，表明ExoS和ExoT的GAP与ADPRT结构域并非通过调节入侵频率，而是通过影响入侵后细菌的囊泡逃逸和胞质复制来决定胞内命运。ExoS ADPRT活性是驱动这一过程的关键，且可从胞外细菌递送来调控胞内细菌的状态。此外，本研究首次报道了ExoT的自ADP-核糖基化以及14-3-3β作为ExoS/ExoT底物的现象，拓宽了对效应器调控网络的理解。

**研究结论**
综上所述，本研究进一步理解控制铜绿假单胞菌胞内定位的分子机制以及T3SS外毒素在决定囊泡居留和胞质复制中的贡献。研究数据为ExoS和ExoT新认识到的功能提供了基础证据，并对理解铜绿假单胞菌胞内感染动态具有广泛意义。此外，本研究进一步强调了存在长期存活的T3SS^?囊泡亚群，这些细菌值得作为持留菌（persisters）进行探究。