综述：细胞色素氧化酶在细菌毒力中的作用

《Infection and Immunity》：The role of cytochrome oxidases in bacterial virulence

　　

细菌生理学在毒力中起重要作用。作为病原体在能量上代价高昂，需要产生专门的毒力因子和其他蛋白质以在宿主体内存活。细菌产生毒力所需能量的最有效方式是通过电子耦合氧化磷酸化（oxidative phosphorylation），以氧为末端受体，也称为有氧呼吸（aerobic respiration）。细胞色素氧化酶（cytochrome oxidases, COs）是有氧呼吸中电子传递链（electron transport chain, ETC）的关键组分。在临床相关细菌中研究细胞色素氧化酶在感染中的作用表明，它们通常在低氧环境中也至关重要，例如胃肠道。因此，细胞色素氧化酶——尤其是与毒力最相关的bd型（bd-type）——正在被探索作为可能的抗菌药物靶点。然而，大多数生物中细胞色素氧化酶（尤其是非bd型）在感染中的作用机制仍不清楚。在这篇综述中，研究人员总结了细胞色素氧化酶在感染中的作用，重点介绍了四种病原体：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia coli, UPEC）（其中bd型细胞色素氧化酶在感染中的作用已进行机制研究），以及霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）（其中非bd型细胞色素氧化酶有助于感染）。这些例子表明需要评估细胞色素氧化酶在更广泛的细菌病原体中的作用。

**引言（INTRODUCTION）**
研究人员传统上专注于鉴定和表征毒力因子，但宿主-病原体相互作用的深入研究使领域认识到细菌生理学在感染中的作用。细菌需调整生理以适应感染期间占据的各种微环境，否则无法存活致病。这种生理适应的主要组成部分是产生足够能量以合成生物分子。分解代谢释放能量，用于驱动氧化磷酸化（respiration）或底物水平磷酸化（fermentation）。有氧呼吸（aerobic respiration）比发酵产生更多ATP，因此当末端电子受体可用时更为有利。在抗生素耐药性上升的时代，理解细菌生理学可揭示新治疗机会。许多抗生素依赖呼吸产生的质子动势（proton motive force）进入细胞，但一些细菌通过进入代谢休眠状态产生耐受性。耐受性持续菌群被认为是治疗失败和复发感染的原因之一。对结核分枝杆菌的研究表明，抑制电子传递链（ETC）组分（包括细胞色素氧化酶COs）可清除抗生素耐受群体，因此靶向COs是广谱抗菌药物开发的潜在方向。本综述总结细菌COs在哺乳动物感染中的作用，特别是与感染最相关的bd型（bd-type）COs。

**细胞色素氧化酶催化有氧呼吸中电子传递耦合氧化磷酸化的最后一步（CYTOCHROME OXIDASES CATALYZE THE FINAL STEP OF ELECTRON TRANSPORT-COUPLED OXIDATIVE PHOSPHORYLATION DURING AEROBIC RESPIRATION）**
COs（也称末端氧化酶）是有氧呼吸ETC的关键组分。电子从供体转移到对电子亲和力更高的受体，利用氧化还原电位推动质子跨膜形成梯度，驱动ATP合成。原核生物通常使用分支ETC，包含多种末端氧化酶（有氧呼吸）和/或末端还原酶（厌氧呼吸），以适应不同环境。COs根据所整合的血红素类型（heme a, b, c, d, o）命名，如bd型（bd-type）使用heme b和heme d，aa₃型（aa₃-type）使用heme a。多数COs（包括真核生物）是血红素-铜氧化酶（heme-copper oxidases, HCOs），但细菌和古菌有独特的仅含血红素类COs即bd型（bd-type）。COs还根据与ETC电子载体的相互作用（醌氧化酶或细胞色素c氧化酶）及对氧的亲和力（高或低）分类。低亲和力COs在常氧下效率高，高亲和力COs可在微氧条件下工作但效率较低。本综述重点介绍四种与细菌毒力相关的COs：低亲和力的aa₃型（细胞色素c HCO）和bo₃型（醌HCO），以及通常高亲和力的cbb₃型（细胞色素c HCO）和bd型（醌氧化酶）。bd型的一个亚类称为氰化物不敏感氧化酶（cyanide-insensitive oxidases, CIOs）是低亲和力但对氰化钾有较高抗性。

**细胞色素氧化酶，尤其是bd型，与病原体的毒力和组织嗜性相关（CYTOCHROME OXIDASES, ESPECIALLY BD-TYPE CYTOCHROME OXIDASES, ARE LINKED TO VIRULENCE AND TISSUE TROPISM IN PATHOGENS）**
研究者在许多临床相关病原体中发现COs对毒力重要。多数研究生物（82%）在感染期间依赖bd型COs（单独或与其他CO联合）。在HCOs中，aa₃型涉及感染的比例为18%，bo₃型14%，cbb₃型9%。被研究病原体大多（74%）是兼性厌氧菌，不单独依赖有氧呼吸。五种专性需氧菌中四种是分枝杆菌属种。多数病原体感染低氧组织尤其是胃肠道（占33%）。另一趋势是大多数病原体（76%）在感染期间采用细胞内生活方式。细胞内细菌面临不同环境条件，需要独特的呼吸策略，如尿路致病性大肠杆菌（UPEC）。

**bd型细胞色素氧化酶具有与其毒力作用相关的独特特性（BD-TYPE CYTOCHROME OXIDASES HAVE UNIQUE PROPERTIES THAT ARE IMPLICATED IN THEIR ROLES IN VIRULENCE）**
bd型COs在进化上不同于HCOs，无序列同源性。它们至少分为三个家族，由两到四条多肽链组成。核心结构包含两个亚基，协调三个血红素（两个heme b和一个heme d），并含有醌结合结构域Q-loop。与HCOs不同，bd型COs不泵送质子，而是通过醌氧化（胞外释放质子）和氧还原（消耗胞质质子）产生质子动势。bd型COs除能量产生外还能直接解毒活性氧和氮物种（如过氧化氢、过氧亚硝酸盐），并且比HCOs更能抵抗感染中遇到的抗菌物（如活性氧/氮物种、硫化氢）。在大肠杆菌中，cydAB基因表达受低氧、pH变化、高温、质子梯度耗散及氰化钾等毒素诱导。由于bd型COs对毒力重要且仅存在于细菌和古菌，它们已被强调为潜在药物靶点。不同生物中bd型COs作用机制各异：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）中用于再生NAD+，志贺氏菌（Shigella flexneri）中通过有氧呼吸耗尽氧以创造低氧条件。多数情况下特定COs被需要的原因尚未确定。

**靶向结核分枝杆菌中的bd型细胞色素氧化酶是治疗耐多药结核病的有前景方向（Targeting a bd-type cytochrome oxidase in Mycobacterium tuberculosis is a promising direction for treating multidrug-resistant tuberculosis）**
结核分枝杆菌能进入代谢休眠非复制状态，导致抗生素耐受。其编码两种COs：bc₁-aa₃超复合物（优势CO）和bd型CO（cydAB）。在动物模型中，bd型CO比bc₁-aa₃更重要：aa₃型表达在感染过程中下降，bd型诱导表达。缺失bd型CO的菌株在竞争感染中后期缺陷明显，依赖于干扰素信号引起的吞噬体酸化。由于aa₃型CO在酸性条件下受抑制，缺失bd型CO的菌株在酸化吞噬体中被优先杀灭。因此，结核分枝杆菌依赖bd型CO因其对适应性免疫抗微生物作用有抵抗性。靶向bc₁-aa₃复合物的抑制剂（如Q203）与缺失bd型CO具有合成致死效应，并与贝达喹啉（bedaquiline）处理具有协同作用。

**胞内尿路致病性大肠杆菌利用bd型细胞色素氧化酶不仅进行呼吸，还操纵宿主细胞代谢以获利（Intracellular uropathogenic E. coli utilize a bd-type cytochrome oxidase not only to respire but also to manipulate the host cell metabolism to its advantage）**
尿路感染（UTIs）主要由尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引起。在感染中，UPEC胞外和胞内均存在，面临低氧张力。UPEC编码三种COs：bo₃型（常氧下主要）和两种bd型（cydABX和appBC）。由cydABX编码的bd型CO在感染中起更大作用，对胞内外UPEC建立感染和持续菌尿均必需。最新研究发现：引入CydA K252A突变（破坏醌结合和heme b相互作用，消除呼吸活性但保留解毒能力）的菌株在胞外存活正常，但胞内存活缺陷。说明胞外UPEC需要bd型CO解毒一氧化氮，胞内则需要其介导的氧化作用。UPEC感染以细胞色素bd依赖方式损害宿主线粒体效率、破坏线粒体融合。作者假设bd型CO（对氧亲和力比人细胞色素c氧化酶高约1000倍）降低胞质氧可用性，触发宿主细胞缺氧反应，诱导缺氧诱导转录因子HIF-1，将宿主代谢转向有氧糖酵解并拮抗凋亡通路。因此，UPEC利用高亲和力bd型CO比宿主细胞更高效利用氧，产生高度低氧环境，改变宿主代谢并阻止凋亡。

**其他细胞色素氧化酶在感染中的机制作用尚不明确（THE MECHANISTIC ROLE OF OTHER CYTOCHROME OXIDASES DURING INFECTION IS LESS CLEAR）**
由于bd型COs独特特性及避免靶向HCOs的脱靶效应，优先研究bd型是合理的。但其他COs被需要时原因尚不清楚。理解HCOs在感染中的机制作用对全面了解有氧呼吸必不可少。

**bd型和cbb₃型细胞色素氧化酶对霍乱弧菌小肠定殖均重要（Both bd-type and cbb₃-type cytochrome oxidases are important for V. cholerae colonization of the small intestine）**
霍乱弧菌（V. cholerae）有四种有氧呼吸COs：一种cbb₃型和三种bd型（bd-I、bd-II、bd-III），并编码四种厌氧呼吸末端还原酶。在乳鼠模型中，有氧呼吸对小肠定殖必需，厌氧呼吸非必需。单个CO缺失在单菌感染中无影响，但竞争实验显示bd-I重要。体外表达数据预测bd-I和cbb₃在感染中重要。缺失cbb₃和bd-I的菌株无法定殖，仅保留bd-I的菌株达到野生型水平，仅保留cbb₃的菌株有缺陷。表明bd-I是主要CO，但bd型和cbb₃型均需协同工作。

**bo₃型细胞色素氧化酶是支气管败血波氏杆菌感染哺乳动物呼吸道最重要的细胞色素氧化酶（A bo3-type cytochrome oxidase is the most important cytochrome oxidase for Bordetella infection of the mammalian respiratory tract）**
经典波氏杆菌（Bordetellae）包括百日咳杆菌（B. pertussis）和支气管败血波氏杆菌（B. bronchiseptica）。B. bronchiseptica预测编码八种COs（包括cbb₃、两种bd型、一种CIO、两种bo₃型、一种aa₃型及一个孤立aa₃催化亚基），而B. pertussis仅保留三或四种（bd型、bo₃型、aa₃型）。研究发现，在鼠感染模型中，单个CO缺失无影响；仅保留bo₃型CO的菌株（cyo1+）达到野生型菌量，而仅保留bd型或aa₃型的菌株有缺陷。因此，bo₃型CO是感染期间的主要CO，bd型和aa₃型起辅助作用。这与大多数生物中bd型为主的情况不同，表明在该生物中靶向bd型CO无效，可能需要同时靶向所有三种保守COs。

**抑制细胞色素氧化酶的治疗潜力与挑战（THERAPEUTIC POTENTIAL AND CHALLENGES OF INHIBITING CYTOCHROME OXIDASES）**
靶向ETC和COs可应对耐药细菌群体挑战，但bd型COs单独抑制通常不够，因为细菌呼吸链灵活且编码多种COs。药物与常规抗生素联用可能增强疗效。目前对COs在感染中作用的理解仅限于少数病原体，需进一步研究以确定趋势是否普遍适用。应优先研究威胁最大的病原体（如ESKAPE及CDC指定紧急威胁的物种），借鉴结核分枝杆菌的研究，可能发现治疗严重疾病的新方法。