CD8ɑ+细胞在停药后控制期间抑制SIV复制且MHC-I限制性表位内未出现突变

《Journal of Virology》：CD8ɑ+ cells suppress SIV replication without the development of mutations within MHC class-I-restricted epitopes during post-treatment control

　　

后治疗控制（PTC）是指HIV感染者（PLWH）在抗逆转录病毒治疗（ART）中断后维持病毒控制的罕见现象。对PTC个体中病毒群体的表征有助于阐明免疫控制机制，但在无可检测血浆病毒血症的情况下，这一工作面临挑战。为模拟PTC，研究人员对8只毛里求斯食蟹猴（MCMs）进行SIVmac239M条形码病毒感染，并于感染后2周（wpi）启动为期8个月的ART方案。ART中断6个月后，所有MCMs用非条形码SIVmac239进行再次攻击，2个月后实施CD8ɑ⁺细胞耗竭。根据ART中断至CD8ɑ⁺细胞耗竭期间血浆病毒血症的检测结果，将动物分为病毒血症组（n=5）和无病毒血症组（n=3）；所有动物在耗竭后均出现病毒血症。血浆病毒的条形码测序揭示，高 pre-ART 病毒载量的谱系在耗竭后反弹的病毒群体中占主导地位，且在两只动物耗竭后可检测到再次攻击病毒。对血浆病毒中三个CD8⁺ T细胞表位的额外测序显示，仅在耗竭后病毒血症组动物的病毒中鉴定出点突变。研究人员进一步检查了第二组5只于8 wpi启动ART的MCMs，以确定ART启动时机对病毒表位多样性的影响，结果显示在ART启动前和ART中断后多样性增加。这些结果提示，早期ART启动与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位内多样性降低及反弹时间延长相关，同时强调了限制变异CTL表位出现在提高PTC可能性中的重要作用。

该研究发表于《Journal of Virology》，旨在利用非人灵长类动物模型深入探讨后治疗控制（PTC）期间病毒群体的动态变化及其与CD8⁺ T细胞免疫控制的关系。研究背景源于HIV/AIDS治疗领域的一个核心难题：尽管ART能够有效抑制病毒复制，但终身服药带来诸多挑战，而少数被称为PTC的个体可在ART中断后维持长期病毒控制。然而，PTC在人群中的发生率仅为4%–16%，其低水平或检测不到的病毒血症使得全面分析病毒群体多样性、复制动态及病毒储存库稳定性极为困难。现有研究表明，ART期间病毒进化几乎停滞，反弹病毒多源于ART启动时频率最高的病毒谱系，但PTC期间病毒储存库的组成是静止还是存在亚临床水平的复制及免疫逃逸突变累积，尚不清楚。CD8⁺ T细胞（CTL）在HIV/SIV感染控制中起关键作用，可驱动病毒进化；MHC-I限制性CD8⁺ T细胞表位内的免疫逃逸变异与病毒控制丧失相关，但也可见于自然控制者中。目前尚不清楚PTC与未经治疗的自发控制有何差异，以及PTC期间CTL表位是否会累积突变。

为探究上述问题，研究人员开展了以下研究。主要采用毛里求斯食蟹猴（MCMs）感染SIVmac239M条形码病毒模型，结合深度测序技术。首批8只MCMs于感染后2周启动8个月ART，中断6个月后进行同源性SIVmac239再次攻击，2个月后实施CD8ɑ⁺细胞耗竭。另设第二批5只MCMs于感染后8周启动22个月ART，以比较ART启动时机的影响。关键技术方法包括：（1）SIV条形码测序：通过检测vpx与vpr间34bp插入序列区分约10,000个独特病毒谱系；（2）全基因组测序：采用重叠扩增子覆盖整个SIV编码序列；（3）MHC-I限制性CD8⁺ T细胞表位测序：针对Gag386–394GW9、Nef103–111RM9和Rev59–68SP10三个表位进行分析；（4）流式细胞术检测CD8⁺细胞频率及表型；（5）病毒载量定量（qPCR）；（6）Bray-Curtis相异指数计算表位序列组成差异；（7）逻辑回归模型分析pre-ART病毒载量与谱系再激活的关系。

研究结果部分按以下结构展开：

**急性感染期间病毒谱系数与ART中断后病毒血症检测无关。** 研究人员测序了pre-ART血浆中的SIVmac239M条形码，评估了ART启动前及CD8ɑ⁺细胞耗竭后各动物中独特谱系数量。结果显示，ART中断后反弹与未反弹MCMs在pre-ART峰值期检测到的谱系数无差异；但无病毒血症动物在CD8ɑ⁺细胞耗竭后的独特谱系数显著多于病毒血症动物（P=0.0357，Mann-Whitney检验）。

**ART中断后仅少数病毒谱系再激活。** 8个月ART后，3只动物出现短暂可检测病毒血症，1只出现延迟持续反弹。测序显示每只动物每个时间点仅能鉴定出2–4个独特谱系，表明pre-ART与反弹病毒群体之间存在强烈的遗传瓶颈效应。

**大多数动物对SIVmac239再次攻击不易感。** 所有动物静脉接受100 TCID50非条形码SIVmac239再次攻击，攻击后即刻所有动物血浆中可检测到94%–100%的攻击病毒。但仅cy1037在攻击后即刻、cy1044在CD8ɑ⁺细胞耗竭后检测到攻击病毒。cy1037攻击后及耗竭后病毒群体主要由攻击病毒组成；cy1044仅在耗竭后约7天单一时间点检测到约1%攻击病毒，提示攻击病毒可建立感染但复制短暂且可被自发控制。

**ART中断后检测的病毒谱系通常源自pre-ART复制水平最高的谱系。** 通过按pre-ART峰值病毒载量对谱系排序，研究人员发现病毒血症组动物反弹谱系多源自pre-ART分布顶部；但并非所有post-depletion谱系都在post-ART或post-rechallenge时复制，如cy1037和cy1040。pre-ART复制水平高的谱系能大量播种病毒储存库并在治疗中断后反弹，而复制水平低的谱系在CD8介导的病毒复制控制被解除时也能贡献于复制能力病毒储存库。无病毒血症动物post-depletion反弹谱系广泛分布于pre-ART条形码分布，而病毒血症动物则集中于分布顶部。

**Pre-ART病毒复制可预测ART中断后及耗竭后谱系再激活的可能性。** 逻辑回归分析显示，pre-ART病毒载量曲线下面积（AUC）在4只病毒血症动物中的3只是post-ART反弹的显著预测因子（模型1，P<0.05）；扩展至post-ART至尸检期间，pre-ART病毒载量AUC在除cy1037和cy1045外的大多数动物中均为显著预测因子（模型2，P<0.05）。纳入post-ART或post-rechallenge检测变量通常不改善模型拟合，且post-ART或post-rechallenge检测不是post-depletion反弹的显著预测因子（模型3、4，P>0.1），仅cy1037例外（模型3，P=0.01），因其攻击后病毒群体主要由攻击病毒组成。

**CD8ɑ⁺细胞耗竭时无病毒血症组动物的CTL表位序列与接种物匹配，但随着CD8ɑ⁺细胞恢复出现序列变异。** 鉴定了三个MHC-I限制性CD8⁺ T细胞表位：Mafa-A1*063限制的Gag386–394GW9和Nef103–111RM9，以及Mafa-B*075限制的Rev59–68SP10。Pre-ART时CTL表位序列与接种物几乎100%一致。CD8ɑ⁺细胞耗竭后约1周，无病毒血症组动物病毒中三个CTL表位主要匹配接种物，而病毒血症组几乎全为变异型。耗竭后3–4周，NK细胞和总体CD8ɑ⁺细胞恢复时，两组动物均检测到表位变异。cy1037因病毒群体几乎全为攻击病毒而被排除表位分析。

**MCMs病毒反弹与pre-ART已存在的CTL表位变异相关。** 比较延迟ART组（8 wpi启动22个月ART，5只MCMs）与早期ART病毒血症组。延迟ART组ART中断后2–6周出现可检测持续病毒血症，与早期ART组形成鲜明对比。Pre-ART和post-ART首个病毒载量>10³拷贝/mL时间点，早期ART病毒血症组表位主要为野生型，而延迟ART组在两个时间点均主要为变异型。Bray-Curtis相异指数显示延迟ART组（中位数>0.37）高于早期ART病毒血症组（中位数<0.16），提示pre-ART CTL表位突变可能导致持续表位多样化。

讨论部分综合分析了上述发现的意义。研究人员指出，该研究利用独特机会检查了8只SIVmac239M感染MCMs的病毒群体，这些动物于2 wpi启动ART并表现出不同程度的PTC。主要结论包括：大多数动物对同源性再次攻击不易感；两个易感动物在攻击病毒检测程度上差异显著；ART中断后反弹的谱系通常具有高水平pre-ART复制，且pre-ART而非post-ART或post-rechallenge复制是病毒再激活的预测因子；无病毒血症动物在PTC期间未在MHC-I限制性CD8⁺ T细胞表位内产生突变。

这些发现与最近Trémeaux等描述的人类PTC结果一致，即PTC个体中MHC限制性CD8⁺ T细胞表位内病毒多样性较低。限制病毒复制进而限制病毒进化是实现无ART持续缓解的治疗目标之一。关于pre-ART病毒载量AUC作为post-depletion再激活主要预测因子的发现，与先前在RM中的研究一致，即瞬时病毒复制对反弹群体影响有限，需要较高程度复制才能改变储存库组成。虽然本研究结果表明反弹病毒群体源于pre-ART群体中占比较大的谱系，且在低或检测不到病毒血症时该群体变化不显著，但不能据此断定储存库不能在大量病毒复制后重新播种或改变。

CD8ɑ⁺细胞耗竭后约3–4周检测到表位变异的时间延迟，支持SIV在PTC期间未发生进化的假说，因为CD8⁺细胞在此期间发挥了抑制病毒复制的作用。一种替代假说是非细胞毒性CD8⁺ T细胞机制在不选择CTL逃逸变异的情况下抑制病毒转录。研究强调了早期ART启动在限制病毒多样性和提高PTC可能性中的重要性，延迟ART启动即使只有数周，也可能允许新变异在病毒群体中累积，减少建立PTC的可能性。关于再次攻击的研究显示，虽然大多数动物受到保护，但保护程度差异很大，cy1044中攻击病毒的低频率检测提示其可建立持续性低水平感染但被自发控制，这对理解PTC个体的再感染易感性具有参考意义。

研究结论部分翻译如下：该研究表明MCMs具有建立PTC的独特倾向，强调了早期ART启动在限制病毒多样性和提高PTC可能性中的重要性，以及抗病毒CD8⁺细胞在PTC期间控制病毒复制中的关键作用。进一步研究这一潜在模型可能使研究人员探索抗病毒CD8⁺细胞对PTC的贡献。研究人员提供了ART治疗期间及PTC期间病毒储存库组成保持稳定的证据，同时提示即使病毒血症被自发重新控制，短暂的病毒复制爆发也可能影响这一组成。这一发现凸显了理解可检测病毒复制缺失情况下病毒储存库维持机制的重要性。此外，研究发现ART启动前SIV感染持续时间较长的动物具有更多样的pre-ART和post-ART病毒群体，且病毒反弹时间显著早于早期ART对应动物。总之，本研究数据为PTC提供了非人灵长类动物模型证据，可能使研究人员更全面理解抗病毒CD8⁺细胞在持续ART缺失情况下建立和维持病毒血症控制中的贡献，以及这些细胞如何在PTC期间限制病毒进化。