烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂FK866通过干扰病毒聚合酶活性限制甲型流感病毒复制

《Journal of Virology》：The nicotinamide phosphoribosyltransferase inhibitor FK866 restricts influenza A virus replication by perturbing viral polymerase activity

　　

烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT），作为NAD⁺合成中的关键限速酶，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。然而，NAMPT在甲型流感病毒（IAV）感染及发病机制中的功能及其潜在机制仍不明确。本研究中，体外实验表明NAMPT对IAV的复制具有显著影响。使用NAMPT抑制剂FK866处理或破坏NAMPT表达可显著减弱多种IAV亚型（包括H1N1、H3N2和H9N2）的复制。此外，与未处理的IAV攻毒动物相比，经FK866处理的小鼠表现出明显的IAV感染抵抗力，表现为组织损伤程度更低、体重下降更慢以及存活率更高。机制上，NAMPT与病毒聚合酶碱性蛋白1（PB1）相互作用，并促进PB1与聚合酶酸性蛋白（PA）及聚合酶碱性蛋白2（PB2）的结合。抑制或敲低NAMPT可限制病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的活性，从而抑制IAV的转录与复制。进一步，研究人员鉴定出PB1的精氨酸203是其与NAMPT相互作用的关键残基。PB1的突变（精氨酸203变为脯氨酸，R203P）阻碍了PB1与NAMPT、PA及PB2的结合，进而削弱RdRp活性并限制IAV的转录与复制。综上，这些发现揭示了NAMPT在调控IAV复制中的关键作用，并阐明了NAMPT抑制剂FK866抗IAV的抗病毒特性，为开发新型抗流感策略提供了思路。

**论文解读文章**

**研究背景及问题**

甲型流感病毒（IAV）属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是引起人和动物急性呼吸道疾病的主要病原体，对公共卫生构成重大威胁。IAV具有高频率变异的特性，曾引发多次灾难性大流行（如1918年H1N1西班牙流感、1957年H2N2亚洲流感和1968年H3N2香港流感），造成数百万死亡。目前抗流感药物面临耐药性限制，且缺乏针对不同亚型的广谱抗病毒药物。IAV的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）由聚合酶碱性蛋白1（PB1）、聚合酶碱性蛋白2（PB2）和聚合酶酸性蛋白（PA）组成，其与病毒RNA（vRNA）及核蛋白（NP）组装成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体，负责病毒的转录与复制。IAV复制高度依赖宿主因子，这为抗病毒策略提供了潜在靶点。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）合成的限速酶，在癌症和病毒感染中发挥重要作用。其抑制剂FK866已被证实可诱导肿瘤细胞凋亡并抑制乙型肝炎病毒相关肝癌细胞增殖。然而，NAMPT在IAV感染中的功能及靶向NAMPT限制IAV感染的潜力尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明NAMPT在IAV复制中的作用机制，并评估FK866的抗IAV效果。

**研究内容与结论**

研究人员发现NAMPT抑制剂FK866在体外和体内均能显著抑制IAV复制，且对多种亚型（H1N1、H3N2、H9N2）具有广谱抗病毒活性。机制上，NAMPT与病毒PB1蛋白相互作用，促进PB1与PA和PB2的组装，从而增强vRNP复合体活性；FK866通过抑制NAMPT破坏这一相互作用，进而削弱RdRp活性，阻断IAV的vRNA、互补RNA（cRNA）和信使RNA（mRNA）合成。此外，口服FK866可减轻IAV感染小鼠的体重下降、组织损伤和病毒载量，提高存活率。关键残基PB1的精氨酸203（R203）被鉴定为NAMPT结合所必需，其突变（R203P）阻断了NAMPT-PB1相互作用并抑制病毒复制。该研究发表于《Journal of Virology》，揭示了NAMPT作为抗IAV药物靶点的潜力，并为开发广谱抗流感策略提供了新思路。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了人肺腺癌上皮细胞（A549）和犬肾细胞（MDCK）作为宿主细胞模型，病毒株包括H1N1（A/PR/8/34、A/WSN/1933、CT F4）、H3N2（A/swine/Shandong/HZNL/2023）和H9N2（A/chicken/Fujian/MQ01/2015）。采用TCID₅₀（半数组织培养感染剂量）测定病毒滴度，Western blotting检测蛋白表达，实时定量PCR（qPCR）测定vRNA、cRNA和mRNA水平。通过免疫共沉淀（Co-IP）检测NAMPT与病毒聚合酶亚基的相互作用。利用分子对接和分子动力学模拟预测结合位点，并通过虚拟饱和突变筛选关键残基。采用双荧光素酶报告系统评估vRNP聚合酶活性。小鼠实验选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，口服给药（每两天一次，剂量10 mg/kg），从感染前7天至感染后14天，通过体重、存活率、肺组织病理（H&E染色）及病毒载量评估体内效果。

**研究结果**

**1. NAMPT抑制剂FK866抑制IAV复制**
通过CCK-8实验确定FK866在200 μM以下对A549细胞无显著细胞毒性。Western blotting、qPCR和TCID₅₀实验显示，FK866（10-200 μM）以浓度依赖方式降低H1N1（PR8）的NP和PB2蛋白水平、NP mRNA水平及病毒滴度。在低MOI（0.01）和高MOI（5）感染条件下，FK866在8、16、24 hpi均显著抑制病毒复制。此外，FK866与奥司他韦联用可增强抗病毒效果。

**2. FK866或敲低NAMPT抑制多种IAV亚型复制**
NAMPT活性测定显示FK866有效阻断NAMPT酶活性。在H1N1（PR8、WSN、CT F4）、H3N2和H9N2感染中，FK866处理或稳定表达NAMPT shRNA的敲低细胞中，NP和PB2的mRNA和蛋白水平以及病毒滴度均显著降低。NAMPT过表达则增强IAV复制。FK866对DNA病毒伪狂犬病毒（PRV）也有抑制作用。

**3. FK866减轻小鼠IAV感染**
口服10 mg/kg FK866（每两天一次，共11次）未引起明显肝毒性（ALT、AST等指标正常）。IAV攻毒后，FK866处理组小鼠体重下降减慢，存活率从10%提高至50%，肺组织中NP mRNA和病毒滴度在3和5 dpi显著降低。H&E染色显示FK866处理组肺组织炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽和组织损伤明显减轻，且促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）和干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）表达水平下降。

**4. FK866在病毒进入后早期阶段抑制IAV复制**
时间点抑制实验显示，FK866仅在感染后（post-infection）添加时具有抗病毒效果，而非感染前或共感染阶段。进一步在1-6 hpi分别添加FK866，结果发现仅在1-3 hpi添加时显著降低NP和PB2蛋白水平、NP mRNA水平和病毒滴度，表明FK866作用于病毒进入后的早期复制阶段。

**5. FK866或敲低NAMPT损害IAV转录和复制**
双荧光素酶报告实验显示FK866处理降低vRNP活性。qPCR检测发现，FK866处理或NAMPT敲低后，IAV感染的A549细胞中NP的vRNA、cRNA和mRNA水平均显著下降。在转染Pol I驱动NA或NP vRNA质粒的HEK293T细胞中，FK866同样抑制vRNA、cRNA和mRNA合成。使用转录失活突变体PB2-E361A的实验进一步证实FK866抑制依赖vRNP的vRNA和cRNA生成。

**6. NAMPT促进PB1-PA和PB1-PB2相互作用**
Co-IP实验表明NAMPT-HA可拉下PB1-Flag和PA-Flag，但不拉下PB2-Flag和NP-Flag；反向Co-IP证实PB1-Flag可拉下内源性NAMPT。在IAV感染的A549细胞中，抗PB1抗体可拉下内源性NAMPT。NAMPT敲低显著减弱PB1与PA、PB2之间的相互作用，以及NP与PA的相互作用，表明NAMPT促进vRNP复合体组装。

**7. PB1的精氨酸203（R203）对NAMPT结合至关重要**
分子对接显示NAMPT-PB1结合能（-33.10 kcal/mol）强于NAMPT-PA（-31.29 kcal/mol）。分子动力学分析鉴定PB1 R203为关键残基，虚拟饱和突变预测R203P突变会破坏结合。Co-IP验证PB1-R203P-Flag与NAMPT-HA的结合显著弱于野生型；且PB1-R203P拉下PA和PB2的量也减少。双荧光素酶报告实验显示PB1-R203P降低vRNP活性；qPCR检测表明PB1-R203P抑制NP和NA的vRNA、cRNA和mRNA合成。序列分析显示R203在IAV不同亚型中高度保守。

**讨论与结论**

IAV在感染过程中劫持宿主细胞机制以支持RdRp功能，宿主蛋白成为抗病毒药物潜在靶点。本研究发现NAMPT抑制剂FK866在体外和体内有效抑制IAV复制，且对H1N1、H3N2、H9N2亚型均有广谱活性。FK866在病毒进入后早期（1-3 hpi）发挥作用，不干扰吸附和侵入，而是抑制vRNP活性。机制上，NAMPT与PB1结合并促进PB1-PA/PB2组装，PB1 R203是关键结合位点。R203P突变破坏NAMPT结合并抑制病毒转录复制。体内实验中口服FK866提供50%保护，可能与药物肺部递送效率有关，未来可考虑纳米颗粒递送以提高疗效。此外，FK866可能通过调控代谢或凋亡信号通路发挥抗病毒作用，需进一步研究。

**研究结论部分翻译**：综上，本研究表明NAMPT抑制剂FK866可抑制多种IAV亚型（H1N1、H3N2和H9N2）的复制。此外，FK866干扰病毒聚合酶活性，从而限制IAV的转录与复制。这些发现揭示了NAMPT在调控IAV复制中的关键作用，并提示靶向NAMPT可能是抗IAV感染的潜在抗病毒策略。