《Journal of Virology》：NFX1-123 is required for keratinocyte differentiation and HPV 16 DNA maintenance in early and persistent infection models
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摘要：高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, HR HPV）的持续感染导致全球近5%的癌症，包括宫颈癌及口咽癌。HR HPV通过在基底角质形成细胞（keratinocyte）中维持病毒基因组拷贝并利用上层细胞分化过程
摘要：高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, HR HPV）的持续感染导致全球近5%的癌症，包括宫颈癌及口咽癌。HR HPV通过在基底角质形成细胞（keratinocyte）中维持病毒基因组拷贝并利用上层细胞分化过程协调病毒生命周期关键步骤，从而在复层上皮组织中建立长期感染。研究人员此前已证实内源性宿主蛋白NFX1-123可直接结合HR HPV 16癌蛋白E6（16E6），该互作促进角质形成细胞增殖与分化——二者均为HPV 16持续性感染所必需。鉴于正常基底角质形成细胞中NFX1-123内源性表达水平存在差异，研究人员旨在探究NFX1-123丰度对HPV 16感染起始及持续的影响。本研究使用过表达、内源性水平及敲低NFX1-123的角质形成细胞，以HPV 16 quasivirus（Qsv）感染，分析NFX1-123调控下角质形成细胞生长及病毒DNA拷贝数的变化。NFX1-123敲低的角质形成细胞在器官型raft培养中分化与分层受损，且HPV 16 Qsv DNA拷贝数降低；同样，在携带游离型HPV 16基因组的宫颈癌细胞系W12E中敲低NFX1-123后，raft培养分化程度与厚度下降，病毒基因组拷贝数较内源性NFX1-123的W12E细胞减少。上述结果表明NFX1-123对HPV 16感染的起始及游离型基因组维持具有重要意义，可能影响感染持续与癌变进程。
论文解读：NFX1-123在HPV 16感染早期建立与持续期病毒基因组维持中的作用
本文发表于Journal of Virology，研究了宿主蛋白NFX1-123（nuclear transcription factor, X-box binding protein 1 isoform 123）在高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, HR HPV）16型感染建立及持续维持阶段对角质形成细胞（keratinocyte, HFK）分化及病毒游离型（episomal）DNA拷贝数维持的功能。
研究背景与目的
HR HPV（尤指HPV 16）持续性感染是宫颈癌等HPV相关恶性肿瘤最主要危险因素。HPV感染基底角质形成细胞后以游离型双链DNA形式维持恒定拷贝数，并劫持宿主细胞蛋白（如E6结合NFX1-123）调控细胞周期与分化。已有研究提示HPV 16 E6直接结合NFX1-123并促进增殖与分化，但正常宫颈基底细胞中NFX1-123内源性表达量不一，其对HPV 16感染起始及游离型基因组维持的作用尚未明确。本研究旨在阐明NFX1-123表达水平变化如何影响HPV 16 quasivirus（Qsv）感染建立、角质形成细胞分化及病毒DNA拷贝数维持，分别在早期感染模型（原代HFK + HPV 16-Hygro Qsv）与持续感染模型（W12E细胞系，含游离型HPV 16基因组）中进行验证。
主要关键技术方法
研究人员构建NFX1-123过表达（FLAG-NFX1-123, FN123）、空载对照（LXSN）、CRISPR-Cas9介导NFX1-123敲除（N123 KO）及敲除对照（CTRL）的原代人包皮角质形成细胞（human foreskin keratinocytes, HFKs，来自生物独立供体A–D）及W12细胞系（含游离型W12E与整合型W12I HPV 16基因组）。使用铺于基质细胞胞外基质（extracellular matrix, ECM）上的HPV 16假病毒（pseudovirus, Psv，包装mCherry）及HPV 16-Hygro quasivirus（Qsv，含潮霉素抗性筛选标记）进行感染。采用单层培养（无血清EpiLife及含饲养层的F Media）与器官型raft培养（organotypic raft culture，模拟复层鳞状上皮分化）评估表型。通过Western blot、RT-qPCR检测蛋白与mRNA，Exonuclease V（ExoV）抗性实验区分游离型与整合型病毒DNA，qPCR定量HPV 16 DNA拷贝数，免疫组化（immunohistochemistry, IHC）检测分化标志物（Keratin 14、Keratin 10、Loricrin），荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）定位病毒基因组，高浓度钙离子（high-dose calcium）诱导单层细胞分化。
研究结果
mCherry pseudovirus和HPV 16-Hygro Qsv感染不同NFX1-123表达水平的原代HFKs
使用mCherry Psv通过ECM法感染FN123、LXSN、N123 KO及CTRL HFKs，各组成像显示感染效率（红色荧光强度及阳性细胞百分比）无显著差异，表明NFX1-123不影响HPV 16衣壳介导的初始进入与早期基因表达启动。随后用HPV 16-Hygro Qsv感染并经潮霉素筛选，经Western blot与RT-qPCR确认NFX1-123调控及病毒E6/E2 mRNA、p53降解与p16INK4A上调，证实成功建立感染模型，可用于后续病毒DNA状态分析。
NFX1-123 knockout blunted HFK growth in organotypic raft cultures with and without HPV 16-Hygro Qsv infection（NFX1-123敲除减弱伴或不伴HPV 16-Hygro Qsv感染的原代HFK器官型raft培养中的生长）
未感染及Qsv感染的FN123、LXSN、N123 KO及CTRL HFKs进行raft培养。H&E染色示N123 KO raft分层变薄，缺乏上基底层角质形成细胞，HPV 16-Qsv感染未能如CTRL那样增厚上皮；FN123与LXSN厚度差异不显著。IHC显示N123 KO raft基底标记Keratin 14及分化标记Keratin 10均低于CTRL，提示NFX1-123是正常角质形成细胞分层与分化所必需。
NFX1-123 correlated with HPV 16-Hygro Qsv DNA copies in differentiating conditions（NFX1-123与分化条件下HPV 16-Hygro Qsv DNA拷贝数相关）
高钙诱导Qsv感染HFKs分化，FN123细胞HPV 16 DNA拷贝数高于LXSN，N123 KO低于CTRL（未分化及分化120 h均如此）。Raft培养FISH显示FN123 raft病毒DNA荧光点（puncta）多于LXSN，N123 KO少于CTRL，说明NFX1-123表达水平与分化角质形成细胞中HPV 16基因组丰度正相关。
NFX1-123 knockout reduced episomal HPV 16 copy numbers in W12E cells（NFX1-123敲除降低W12E细胞中游离型HPV 16拷贝数）
W12E（episomal HPV 16）与W12I（integrated HPV 16）细胞建立N123 KO与CTRL。ExoV证实W12E中HPV 16 DNA保持游离型不受NFX1-123状态影响，但长期培养（late W12E）中N123 KO细胞总HPV 16 DNA拷贝数扩增受抑制，提示NFX1-123对游离型基因组长期维持具支持作用。
NFX1-123 knockout decreased dysplastic phenotypes in W12E cells in organotypic raft cultures（NFX1-123敲除减弱W12E细胞器官型raft培养中的异型增生表型）
W12E及W12I raft培养显示N123 KO W12E上皮厚度减小，核异型性减少，Keratin 14/10/Loricrin染色减弱，与HFK raft结果一致，再次验证NFX1-123对含游离型HPV 16的角质形成细胞分化表型及上皮构筑至关重要。
NFX1-123 knockout blunted HPV 16 copy numbers in differentiated cultures of W12E cells（NFX1-123敲除减弱W12E分化培养中HPV 16拷贝数）
高钙诱导W12E分化，CTRL中120 h出现病毒基因组扩增，N123 KO中此扩增被削弱；ExoV确认仍为游离型。Raft FISH示N123 KO W12E raft病毒puncta少于CTRL W12E，W12I raft无差异。综合表明NFX1-123是分化条件下游离型HPV 16基因组扩增与维持所需。
讨论与结论总结
研究人员指出，NFX1-123主要影响HPV感染建立后的病毒基因组维持与宿主上皮细胞分化，而非病毒进入步骤。NFX1-123敲除损害角质形成细胞分层分化，并伴随游离型HPV 16 DNA拷贝数下降；过表达则支持更高病毒拷贝数。在正常宫颈基底细胞中NFX1-123内源性表达量的个体差异，可能影响个体对HPV持续性感染的易感性及进展风险。在已建立持续感染的W12E细胞中敲低NFX1-123也可降低上皮异型性及病毒游离型拷贝数，提示NFX1-123可作为HPV 16阳性感染及相关癌前病变/肿瘤的潜在治疗靶点。
结论（翻译）
本研究首次证明完整表达的NFX1-123是建立和维持高拷贝数HPV病毒DNA以支持持续性感染及异型增生所必需的。NFX1-123通过促进角质形成细胞生长与分化影响HPV 16生命周期的维持阶段；NFX1-123对典型角质形成细胞分层分化至关重要，其高表达增强基底层增殖，且在HPV 16早期与持续感染中均为分化及游离型HPV 16 DNA维持所必需——此为生产性持续性HPV感染的关键环节。这些发现支持进一步探究NFX1-123作为HPV 16阳性宫颈感染及病变的潜在治疗靶点。
