综述：四级表位在引发针对多种黄病毒广泛中和反应中的作用

《Journal of Virology》：Role of quaternary epitopes in eliciting broad neutralization response against multiple flaviviruses

　　

黄病毒（flaviviruses）或正黄病毒（orthoflaviviruses）是节肢动物传播的RNA病毒，构成重大全球健康威胁，并在全球许多地区共同传播。针对特定致病性黄病毒（如登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼罗病毒（WNV））的中和抗体已广为人知。然而，由于黄病毒的抗原多样性和复杂的体液免疫反应，针对多种黄病毒的疫苗和治疗开发仍具挑战性。近期研究报告了患者来源的、对多种黄病毒具有活性的中和抗体。对这些泛黄病毒抗体的结构表征已鉴定出在多种黄病毒中保守的四级表位（quaternary epitopes），强调了天然黄病毒上四级表位的重要性，这些表位在某些情况下也跨不同病毒形态得以保留。理解四级结构表位识别的基础有助于设计能引发广泛保护且感染增强风险较低的免疫原。在这篇综述中，研究人员讨论了靶向致病性黄病毒上不同四级表位的广泛中和抗体（bnAbs）的机制性见解，以及对下一代泛黄病毒疫苗策略的启示。

**引言（INTRODUCTION）**
黄病毒（flaviviruses）或正黄病毒（orthoflaviviruses）是节肢动物传播的RNA病毒，导致人类严重疾病。该属包括多种重要医学病毒：登革病毒（DENV）、黄热病毒（YFV）、寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）、卡萨诺尔森林病病毒（KFDV）和蜱传脑炎病毒（TBEV），这些病毒构成重大全球健康威胁。每年全球估计有4亿例黄病毒感染。典型黄病毒粒子为直径约50 nm的球形颗粒，表面糖蛋白呈二十面体排列。病毒RNA基因组为约11 kb的正义单链分子，由衣壳蛋白（capsid protein，约12 kDa）包裹形成核衣壳（nucleocapsid）。核衣壳外包裹宿主来源的脂质膜，其外表面密集装饰有两种蛋白：包膜糖蛋白（envelope glycoprotein，E蛋白，约53 kDa）和膜蛋白（membrane protein，M蛋白，约8 kDa）。E蛋白是病毒表面唯一的暴露蛋白，通过受体介导的内吞作用和膜融合介导细胞进入。E蛋白也是关键的抗原决定簇和诱导中和抗体的重要靶点。黄病毒复制周期始于病毒与多种细胞附着因子或受体（如糖胺聚糖、DC-SIGN、硫酸乙酰肝素、甘露糖受体和TIM-1）的相互作用，随后在晚期内体的低pH条件下进行受体介导的内吞和融合。这些步骤由病毒E蛋白的构象变化协调。病毒膜融合后基因组释放，导致内质网（ER）中的病毒基因组复制和蛋白生产。病毒RNA基因组翻译为多聚蛋白，包括三种结构蛋白（C蛋白、前体M蛋白[prM]和E蛋白）及七种非结构蛋白。病毒核衣壳出芽进入内质网腔，获得含有E蛋白和prM蛋白（构成60个三聚体刺突[prM₃E₃]）的膜表面。组装完成的病毒粒子随后通过高尔基体运输，在此发生病毒形态的重大构象变化。不成熟病毒（显示prM₃E₃表面刺突）重排为相对光滑的prM-E二聚体晶格，随后由弗林蛋白酶（furin）切割prM蛋白，将pr肽段与M蛋白分离。切割后，pr蛋白仍覆盖E蛋白并保护病毒融合环。一旦病毒通过胞吐作用离开细胞，在细胞外空间的中性pH下，pr从E蛋白分离，融合环被激发，从而生成成熟、具感染性的病毒粒子。成熟病毒粒子表面显示90个非共价结合的反平行E-M二聚体（M₂E₂），呈人字形排列。然而，这一成熟过程并非总是完全，可导致完全成熟、部分成熟和不成熟病毒粒子的混合群体。这些部分成熟粒子具有感染性，并在黄病毒感染中对抗体识别、中和和增强具有重要意义。尽管不成熟粒子缺乏感染细胞的能力，但已证明完全未成熟病毒粒子在与先前感染产生的抗prM抗体相互作用后也可能变得具有感染性，如DENV中所述。在过去十年中，某些黄病毒中还报道了其他形态。DENV在37–40℃孵育时被报道以膨大/凹凸不平病毒（bumpy virus）形式存在，而某些DENV和ZIKV毒株则显示出管状病毒粒子形式。不同黄病毒毒株形成这些替代形态的倾向各不相同，这一现象先前已综述但尚未完全理解。

**针对黄病毒的免疫反应（IMMUNE RESPONSE AGAINST FLAVIVIRUSES）**
在黄病毒属中，几乎所有病毒都被视为单一物种，具有不同毒株或基因型（如ZIKV、JEV、YFV和WNV）。仅DENV具有明确界定的血清型（I–IV），这些血清型在抗原性上不同，遗传相似性约65%，每种血清型包含多个毒株。因此，感染一种DENV血清型后，患者对后续同一血清型感染保持免疫，但若再感染其他血清型，早期血清型产生的中和抗体可能无效。异源血清型的二次感染因此可能因交叉反应但弱中和的抗体而增加严重感染风险，因为这些抗体可结合病毒并通过Fcγ受体（FcγR）促进病毒-抗体复合物的细胞进入。黄病毒的相似结构架构也在某些情况下导致交叉病毒反应性抗体，例如DENV和ZIKV之间。因此，对于黄病毒，抗体在决定疾病结果中起关键作用，因为并非所有抗体都提供保护，在某些情况下会导致抗体依赖性增强（ADE）和病毒血症增加。除E蛋白外，其他蛋白如prM/M及非结构蛋白NS1、NS3和NS5也被证明是黄病毒的抗原靶点。具体而言，抗prM抗体通过Fc受体介导的内吞促进不成熟病毒粒子的细胞进入，并可能引起ADE。本综述将重点讨论针对病毒E糖蛋白的抗体。针对黄病毒产生的单克隆抗体（mAbs）可分为四类：毒株特异性（Strain-Specific, SS）抗体仅针对特定病毒毒株，可能无法中和同一病毒血清型内的异源毒株；型特异性（Type-Specific, TS）mAbs可识别单一黄病毒多个毒株共有的抗原决定簇；复合反应性（Complex-reactive, CR）mAbs可交叉中和同一血清复合群内的黄病毒；群反应性（Group reactive, GR）mAbs可结合多种黄病毒，跨越不同毒株和血清复合群。关于DENV和ZIKV的SS、TS和CR mAbs的详细综述可参见先前研究。

**黄病毒上的四级表位（QUATERNARY EPITOPES ON FLAVIVIRUSES）**
随着许多关于黄病毒表面表位测定的研究，越来越多的证据表明，最有效的GR或CR性质mAbs识别的是当多个E蛋白在成熟病毒粒子表面组装时出现的四级表位。四级表位源于E蛋白的高阶组织以及二聚体内相邻E单体之间或病毒二十面体晶格中相邻二聚体之间的相互作用。因此，这些表位是构象依赖的，无法通过可溶性E蛋白单体或分离结构域复制。尽管GR和CR bnAbs主要识别四级表位，一些TS-mAbs也如此，例如5J7、1F4、14C10和2D22，它们结合在光滑病毒粒子上展示四级结构的表位。另一种针对WNV的四级特异性抗体CR4345结合由两个相邻E蛋白的蛋白形成的非连续表位。一类称为EDE-C的新抗体（以人mAbs DENV-290和DENV-115为代表）主要通过阻断病毒附着于细胞来中和DENV3病毒。它们的表位位于病毒粒子光滑表面上E蛋白二聚体的中间。因此，只需一个Fab分子结合二聚体中的E原聚体。对于DENV和ZIKV，并非所有GR和CR mAbs都能有效中和异源毒株或物种。在过去十年中，已发现能有效中和多种毒株、血清型和物种的mAbs。这些mAbs被称为针对黄病毒的广泛中和抗体（bnAbs），它们识别病毒E蛋白上高度保守的四级表位，从而中和多种黄病毒。本综述将重点描述这些靶向四级表位的强效黄病毒bnAbs。

**靶向黄病毒四级表位的广泛中和抗体（bnAbs TARGETING QUATERNARY EPITOPES OF FLAVIVIRUSES）**
在黄病毒中观察到的最广泛中和活性见于识别融合环以及E蛋白二聚体上相邻区域组合的抗体。这是多个黄病毒中保守的抗原表面，因为该区域也对应于pr肽在E蛋白上的附着位点。一类充分表征的结合该四级表位（包括融合环和E蛋白相邻区域）的bnAbs被称为E-二聚体表位（E-dimer epitope, EDE）bnAbs。EDE bnAbs跨E二聚体结合并锁定两个E单体，每个E二聚体结合两个Fab，稳定融合前E二聚体构象。EDE bnAbs C8、C10、B7和A11的晶体结构显示它们结合E蛋白上总体相似的表位。EDE bnAbs进一步细分为EDE1和EDE2 bnAbs。EDE1强效中和DENV和ZIKV，其bnAb结合不依赖于DENV E蛋白上的N153糖基化。EDE1 bnAbs（如C8和C10）主要通过轻链参与并使N150环紊乱。相比之下，EDE2 bnAbs有效中和DENV，对ZIKV活性较低，且需要与E蛋白的N153聚糖相互作用。EDE2抗体（如B7和A11）主要通过重链识别E蛋白，轻链仅参与与N153聚糖的相互作用。尽管EDE1 bnAbs的表位重叠且对DENV和ZIKV有效中和，但最近HDX-MS和冷冻电镜（Cryo-EM）研究观察到，在与EDE1-C10抗体相互作用时，DENV和ZIKV的粒子动力学存在差异。对于ZIKV，C10结合降低整体粒子动力学并稳定病毒，而高浓度C10则增加粒子动力学并导致DENV变形。另一类近期表征的人抗体是重链驱动的E-二聚体识别（Heavy Chain-driven E-dimer recognizing, HEDR）bnAbs，它们也能中和所有DENV血清型，并在某些情况下中和ZIKV。HEDR bnAbs结合的总体四级表位与EDE bnAbs相似，其表位覆盖融合环区域以及二聚体中相邻E蛋白的结构域I和结构域III的一部分。HEDR bnAbs结合于E二聚体上保守聚糖N153和N67之间。HEDR bnAbs也可分为两类：类别1（如D14.F25.S02）中和DENV和ZIKV，其中和活性不依赖于N153糖基化；类别2（如J9、D14.F05.S03）仅中和DENV血清型，且需要N153糖基化维持中和活性。尽管全局表位共享，EDE和HEDR bnAbs的具体氨基酸需求不同，HEDR bnAb结合时未见150环的扭曲。此外，HEDR bnAbs优先使用其重链进行大部分表位接触，这与EDE bnAbs不同。除了上述包含融合环和E-二聚体内区域的四级表位外，bnAbs如SIgN3C和K8b也被证明能中和多种黄病毒，这些bnAbs的足迹定位于E-二聚体间区域。SIgN-3C中和所有血清型的DENV和ZIKV，并显示在不同黄病毒中具有不同中和机制：在低pH下锁定DENV表面蛋白，抑制融合；对于ZIKV，则交联病毒粒子，导致聚集并进一步抑制感染。BnAb K8b独特之处在于对DENV、ZIKV和JEV均显示广泛中和活性。基于结构的诱变和低分辨率冷冻电镜结构分析表明，该bnAb也结合四级表位，其重链和轻链参与与E二聚体上结构域I、II和III的相互作用。识别四级表位的bnAbs的一个特征是高中和效力。值得注意的是，EDE和HEDR类抗体表现出极低的IC₅₀值，这对于对抗ADE相关效应是理想的。这些发现强调了靶向四级表位的抗体在中和中的重要性，并强调了在疫苗和免疫原设计中保留天然E-二聚体组织的重要性。

**四级表位靶向抗体对交替病毒粒子形态的识别（RECOGNITION OF ALTERNATE VIRION MORPHOLOGIES BY QUATERNARY EPITOPE-TARGETING ANTIBODIES）**
一些识别四级表位的mAbs也能结合DENV和ZIKV的交替形态。EDE bnAb C10被报道结合DENV和ZIKV的管状形式。类似地，HEDR bnAbs如D14.F25.S02、J9和D14.F05.S03也结合DENV的管状形式。另一个例子是EDE-C bnAb DENV-290，也能结合管状DENV。这些bnAbs的结合使DENV的管状区域以E二聚体为重复单元进行螺旋排列。人单克隆抗体2D22是结合球形光滑和凹凸表面DENV2病毒粒子的mAb实例。在所有实例中，mAb结合表位定位于E二聚体单元，结合机制与相应野生型球形病毒粒子复合物结构中观察到的相似。然而，此类报道较少，需要进一步研究以阐明这些交替形态如何影响病毒感染和ADE。

**对疫苗和免疫原设计的启示（IMPLICATIONS FOR VACCINE AND IMMUNOGEN DESIGN）**
黄病毒构成一个主要且不断扩大的全球公共卫生威胁，由气候变化、城市化和全球旅行驱动。迄今，仅有五种黄病毒（YFV、DENV、JEV、KFDV和TBEV）有许可疫苗。YF-17D（减毒活疫苗）是针对YFV的许可疫苗之一，是最成功的疫苗之一，可诱导终生免疫并产生强中和抗体和T细胞反应。针对JEV，JE-VAX、IXIARO（灭活疫苗）和SA14-14-2（减毒活疫苗）已在亚洲许可并广泛使用。这些疫苗通常能在数周内诱导超过95%的血清转化率，并显示出改进的安全性，主要副作用为轻度、短暂的局部反应如注射部位疼痛和疲劳。最近开发的嵌合病毒（BinJ/JEV NSW/22-prME）在小鼠模型试验中也被证明是针对JEV的安全有效疫苗候选。针对KFDV的许可疫苗是印度生产的0.1%福尔马林灭活组织培养疫苗。尽管该疫苗提供部分保护，但其有限且减弱的效力以及需要频繁加强剂量使得改进疫苗的开发成为必要。针对TBEV的所有许可疫苗（FSME-IMMUN、Encepur、TBE-Moscow）均为灭活全病毒，广泛用于欧洲和亚洲部分地区。所有TBEV疫苗均高度免疫原性，血清转化率在86%至100%之间，但随时间推移免疫力减弱也有报道。对于DENV，多种有效疫苗方法正在进行中。减毒活嵌合YFV-DENV四价疫苗CYD-TDV（Dengvaxia）已上市，但据报道由于ADE增加了血清阴性个体患重症登革热的风险，限制了其使用。近期，TV003/TV005（一种四价减毒活疫苗，由四种重组登革病毒疫苗株组合而成）在III期临床试验中显示出显著保护效力。表达四种DENV血清型prM和E基因的重组四价疫苗DEN-80E和TVDV（来自质粒DNA）已进入I期临床试验。四价减毒活Takeda登革疫苗（TAK-003）以减毒DENV-2 PDK-53毒株（TDV-2）为骨架，并用来自DENV-1 16007（TDV-01）、DENV-3 16562（TDV-3）和DENV-4 1036（TDV-4）的DENV-2 prM和E基因替换，现已在多个国家（包括印度尼西亚和欧盟成员国）以QDENGA名称许可，但尚未获得普遍批准（如美国）。一种编码登革病毒血清型1包膜和前体膜结构蛋白（prM/E mRNA-LNP）的新型mRNA疫苗已开发并通过脂质纳米颗粒递送，被表征并在小鼠模型中引发保护性免疫反应。这些疫苗候选在人中的应用尚未确立，而迄今许可DENV疫苗中观察到的ADE并发症强调了设计能引发对所有DENV血清型平衡反应的疫苗的重要性。ADE相关并发症的担忧是阻碍当前DENV和ZIKV疫苗广泛应用的主要因素。由于疫苗设计中prM蛋白的存在，当前DENV疫苗可能含有结构异质性颗粒，这增加了ADE的可能性。因此，为避免ADE相关并发症，需要新型免疫原设计，优先展示受保护的表位并最小化不合需要抗原位点的暴露。近期关于黄病毒bnAbs的结构研究已确立E二聚体构象和E二聚体排列作为广泛抗原识别重要因素的重要性。此外，结构研究表明，强效bnAbs优先识别成熟病毒粒子上的四级表位，而弱中和抗体倾向于识别在部分成熟粒子和实验室适应毒株中暴露的融合环表位。实验室适应毒株具有动态性质，倾向于暴露融合环，而临床毒株则不是这样。因此，仅针对融合环表位产生的抗体对动力学较弱的临床毒株往往是非中和性的。随后，通过向E二聚体界面引入半胱氨酸残基以共价交联E单体，探索了限制融合环暴露的稳定化免疫原用于DENV血清型1–4。计算蛋白质设计也被用来构建高度表达、热稳定的E二聚体用于DENV血清型1–4和ZIKV，以呈现类似于成熟病毒粒子的表位。模仿病毒糖蛋白表面的免疫原设计有望诱导比单个结构域和肽更好的广泛中和反应。因此，在设计亚单位疫苗时，展示病毒表面蛋白的天然四级结构（如稳定E蛋白二聚体或多聚体组装）已成为改善保护广度和效力的有前景方法。

**结论（CONCLUSION）**
四级表位包含多种黄病毒之间共享的保守结构特征。靶向这些表位的抗体显示出更广泛和更强效的中和活性，而这些表位仅当E蛋白在感染性病毒粒子上以其天然寡聚四级形式组装时才存在。针对黄病毒bnAbs的结构研究已实现对bnAb方法和结合特征的详细表征。对循环病毒群体的进一步分析使我们能够描绘黄病毒不同形态形式的发生。此外，对多种黄病毒感染人群的分析有助于分离更广泛的保护性抗体库，为泛黄病毒疫苗策略的开发铺平道路。