基于STAT3的新型阿洛塞库里宁衍生物作为抗肿瘤药物的体外及体内设计、合成、生物评价及其作用机制

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, bio-evaluation, and mechanism of action of novel allosecurinine derivatives as STAT3-based antitumor agents in vitro and in vivo

　　兰金霞|康思双|黄乐军|江金新|苗志英|谢跃|刘军|苗悦|吴琼雷|李增民|侯文中国江西省赣州市赣南医学院公共卫生与健康管理学院，邮编341000摘要癌症是人类死亡的第二大原因，因此亟需开发新的抗肿瘤药物。我们之前的研究表明，在C-12位点对异阿洛斯库里宁进行衍生化处理是发现可作为抗肿瘤药物的STAT3通路抑制剂的有效途径。在本研究中，我们在C-15位点对异阿洛斯库里宁进行了衍生化处理，检测了其抗肿瘤活性，并阐明了其作用机制。通过赫克反应得到了一系列异阿洛斯库里宁衍生物AH-1~AH-29。我们使用MTT和CCK8试验来检测这些衍生物的抗肿瘤功效，同时探讨了结构与活性之间的关系。此外，还通过划痕试验、流式细胞术和激光共聚焦显微镜来研究细胞表型变化。通过Western blotting分析和CETSA实验来确定代表性化合物AH-26的作用机制。我们还记录了AH-26在大鼠体内的药代动力学参数。最后，在裸鼠体内进行皮下肿瘤移植实验，以评估其体内抗肿瘤活性。研究结果表明，大多数C-15位点的衍生物都具有较高的抗肿瘤活性。其中活性最强的化合物AH-26在癌细胞与正常细胞之间表现出良好的选择性和活性。AH-26能够诱导白血病细胞的线粒体介导的凋亡和分化，抑制SKOV3和HGC-27细胞的迁移，并使细胞周期停留在G1期。进一步的研究表明，AH-26能够稳定STAT3蛋白，从而抑制其磷酸化，这一过程对其抗肿瘤活性至关重要。此外，AH-26还具有抗肿瘤活性且无毒性。这些结果表明，AH-26是一种新型且安全的基于STAT3的抗肿瘤药物。本研究为发现STAT3抑制剂及抗肿瘤药物奠定了基础。引言肿瘤是人类死亡的第二大原因。2026年前几个月，美国就有约2,114,850例新发癌症病例和626,140例与癌症相关的死亡病例[1]。中国则约有4,820,000例新发癌症病例和3,210,000例与癌症相关的死亡病例。癌症的主要治疗方法包括手术、放疗、化疗、靶向治疗以及新兴的生物疗法，如免疫疗法、基因疗法和细胞疗法[2][3]。在这些治疗手段中，靶向治疗在临床应用最为广泛，许多相关药物也已获得美国食品药品监督管理局的批准[4]。STAT3通路是一种由细胞因子激活的信号转导通路，它参与了许多重要的生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节。STAT3通过维持癌干细胞的干细胞特性，促进肿瘤的复发、转移以及不良的临床预后[5][6]。在70%的肿瘤中，如白血病、卵巢癌和胃癌，STAT3通路都会持续或过度激活[7][8][9][10]。抑制STAT3通路可以抑制肿瘤的恶性增殖。多项临床研究已经证实，抑制STAT3通路能够有效阻止肿瘤生长[11][12]。目前有一些STAT3抑制剂，如TTI-101、纳帕布卡辛和OPB-111077，正在临床试验中接受评估[13][14][15]。然而，由于存在脱靶效应、疗效低、选择性差、临床毒性高以及口服生物利用度低等问题，STAT3抑制剂的研发和临床应用仍然面临诸多挑战[16]。目前还没有任何STAT3抑制剂获得用于治疗肿瘤的上市许可。现有的STAT3抑制剂在结构多样性方面存在局限，其治疗效果和安全性也有待提高[17]。因此，研究人员致力于开发新型的STAT3抑制剂。在新药研发过程中，首先需要确定并验证药物靶点。通过筛选获得候选化合物，然后对其进行结构修饰，生成先导化合物。这些先导化合物需要经过针对疗效、药代动力学和安全性的深入优化，最终形成可进入临床前研究和临床研究的候选药物。例如，伊马替尼保留了DFG-out构象结合模式，并通过结构修饰来提高亲和力，同时扩大对耐药突变的抑制范围[18][19]。目前，有多种方法可用于小分子药物的研发。我们较为熟悉的药物发现方法包括传统的高通量筛选以及天然产物提取筛选。这类方法耗时耗力，且寻找合适靶点往往难度较大。另一种方法是通过对已知活性药物的结构进行适度修改，在保持药效团的同时优化物理化学性质，从而开发出新的药物。这种策略具有较低的研究风险和较短的研发周期[20]。此外，现在还有更多先进技术被用于新型小分子药物的发现，比如基于片段的药物发现和基于结构的药物设计。简单来说，基于结构的药物设计是利用已知的目标分子的三维结构，通过分子对接、药效团建模和分子动力学模拟等方法来进行药物设计。徐希及其同事根据已公布的GLS1的X射线晶体结构，合成了一系列大环化合物。通过体外和体内研究，他们发现了一种名为13b的新化合物，该化合物具有很强的抗肿瘤活性，这进一步证明了环化反应是设计和合成抗肿瘤药物的有效策略[21]。通过反复的结构修饰和结构-活性关系分析，可以确定活性和药代动力学特性的变化，从而不断优化分子结构[22]。而基于片段的药物发现则是从筛选分子量小于300的小分子片段开始，寻找弱亲和力的结合剂，然后通过片段扩展、连接或合并等方式逐步优化结构，最终得到高亲和力的先导化合物。通过这种方法发现的分子通常具有新颖的骨架，特别适合用于攻克那些难以用传统方法治疗的靶点[23]。近年来，人工智能、分子对接和计算建模已经深度融入到药物发现和天然产物优化的整个过程中，成为推动药物化学发展的核心力量[24][25]。分子对接技术被广泛应用于多种药物研发过程中[26][27]。计算组学为探索天然产物的分子多样性并促进药物发现提供了新手段，而机器学习则有助于药物设计的优化和活性预测。这两种方法的结合使得天然药物候选物的发现更加高效，不过仍需解决高质量数据获取和算法验证等关键问题[28]。周吉及其同事采用了一种药理学整合位点策略，以两类抑制剂为模板，分析共晶结构并引入噻二唑基团，从而设计了新型IDO1/TrxR1双重靶点抑制剂[29]。叶文冲等人在这篇论文中分析了靶向小分子自噬抑制剂的结构-活性关系及其作用机制，为设计优化抗耐药性自噬抑制剂的药物骨架提供了参考[30]。此外，还有一些前沿技术也在推动药物化学的发展。生成型分子模型利用生成式深度学习模型，包括扩散模型和大型语言模型，从大量已知的分子数据中学习化学规律[31]。它们能够从头生成具有所需活性的全新、可合成的分子结构，从而突破传统高通量筛选中化合物库的局限性，高效地探索潜在的化学空间[32》。《天然产物杂志》上的一篇综述指出，许多临床使用的药物都是直接或间接来源于天然产物[33]。对天然产物进行衍生化处理是发现药物的一种可行策略，尤其是抗肿瘤药物，比如拓扑异构酶I抑制剂伊立替康和微管抑制剂多西他赛[34]。从中药中分离得到的葫芦素是一种STAT3抑制剂，其α, β-不饱和羰基结构在其抑制作用中起着关键作用[35]。从 Securinega suffruticosa 的叶子和根中提取的生物碱Securinine也是一种具有α, β-不饱和酮结构的天然产物，这类生物碱具有多种生物活性[36]。异阿洛斯库里宁属于Securinine的一种，其结构如图1所示。在另一项研究中，我们报道了异阿洛斯库里宁的C-12位点衍生物的设计、合成及其抗肿瘤活性。这些衍生物能够抑制癌细胞中的STAT3通路[37]。然而，目前还没有关于异阿洛斯库里宁C-15位点衍生物的研究报道。在本研究中，我们进一步研究了作为STAT3通路抑制剂的异阿洛斯库里宁衍生物的结构-活性关系。为此，我们设计并合成了多系列异阿洛斯库里宁衍生物，并描述了它们的抗肿瘤活性和作用机制。与之前报道的C-12位点衍生物中活性最高的BA-3相比，经过C-15位点修饰的AH-26具有更强的抗肿瘤活性。具体而言，对于SKOV3细胞，BA-3的IC??值为4.84?μM，而AH-26的IC??值仅为0.04?μM，后者活性是前者的121倍[37]。我们的实验数据表明，代表性化合物AH-26具有较高的抗肿瘤效果且毒性较低。我们还发现AH-26能够抑制STAT3蛋白。化学部分目标分子AH-1~AH-29的合成路线如图1所示。在氮气保护下，异阿洛斯库里宁与各种功能化的芳基碘化物（包括吸电子和给电子取代基）发生赫克反应，该反应在醋酸钯(Pd(OAc)2)和1,3-双(二苯基膦)丙烷(dppp)的催化作用下进行。反应中以碳酸钾(K2CO3)作为碱，1,4-二氧六环作为溶剂，将反应体系加热至80℃并反应8小时。结论我们发现，通过赫克反应在C-15位点对异阿洛斯库里宁进行衍生化处理是一种有效的策略，可用于发现高效的抗肿瘤药物。大多数新型衍生物都表现出较强的抗肿瘤活性，其中AH-26是最具进一步研究价值的候选物。AH-26具有出色的抗增殖活性，大多数测试过的癌细胞对其的IC50值都在纳摩尔级别，这一效果甚至优于阳性对照物CPT。后续研究化学部分这些化合物是通过赫克反应制得的。简而言之，在氮气环境下，向一个装有5毫升干燥1,4-二氧六环的50毫升圆底烧瓶中加入1.5毫米摩尔的碳酸钾、0.05毫米摩尔的醋酸钯以及0.05毫米摩尔的1,3-双(二苯基膦)丙烷，然后在室温下搅拌使物质溶解。接着，向烧瓶中加入1.5毫米摩尔的异阿洛斯库里宁和1毫米摩尔的取代碘苯化合物，将反应体系加热至80℃并反应8小时。CRediT作者贡献声明兰金霞：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、项目管理、实验研究、数据整理。康思双：写作——审阅与编辑、项目管理、方法学研究。黄乐军：项目管理。江金新：监督工作。苗志英：写作——审阅与编辑。谢跃：实验研究。刘军：项目管理。苗悦：结果验证。吴琼雷：结果验证。李增民：结果验证。侯文：写作——审阅与编辑、监督工作、资金支持声明作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究结果的个人关系。致谢本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22367002）、江西省青年科学基金（项目编号20232BAB213043）、江西省教育厅科技研究项目（项目编号GJJ2401302）、江西省大学生创新计划项目（项目编号S202510413017）以及赣南医学院研究生创新基金项目（项目编号）的资助。