应激反应因子SigH介导脓肿分枝杆菌对多种抗生素的内在耐药性

《Microbiology Spectrum》：The stress response factor SigH mediates intrinsic resistance to multiple antibiotics in Mycobacterium abscessus

　　

脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，Mab）是一种致病性快速生长分枝杆菌，其耐药机制复杂且尚未得到充分阐明，治疗选择有限，因此亟需重新深入解析其耐药机制并鉴定新的作用靶点。本研究报道，在Mab中破坏推定σ因子sigH会导致其对左氧氟沙星、莫西沙星、替加环素、四环素、阿米卡星、万古霉素和利福布汀呈现高敏感性。Mab SigH与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）SigH具有84%的肽序列同一性，后者是公认的应激反应蛋白和全局性转录调控因子。采用Mab sigH或其Mtb同源基因对敲除株（ΔsigH）进行互补后，耐药表型得到恢复。此外，与野生型（WT）Mab及互补株相比，ΔsigH对氧化应激和热应激的敏感性增加。转录组分析显示，sigH缺失打破了基因表达平衡，主要表现为编码YrbE和MCE家族蛋白的基因表达升高，而编码ABC型转运蛋白、σ因子和抗σ因子以及其他与抗菌药物耐药相关基因的表达下调。值得注意的是，ΔsigH积累了更多溴化乙锭，并呈现细胞延长表型，这两种现象均可被互补部分逆转。另外，由天然sigH启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）在WT中的荧光强度比ΔsigH高10倍，提示SigH的存在可驱动更高水平的GFP表达。综合而言，本研究鉴定出SigH是调控全局基因表达的关键调节因子，可将应激适应、细胞包膜稳态与内在多重耐药性联系起来，因此是开发抗Mab感染新型治疗药物的一个有前景的靶点。

《Microbiology Spectrum》发表的这项研究聚焦于脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，Mab）内在耐药性的调控基础。Mab属于快速生长非结核分枝杆菌（NTM，指非结核分枝杆菌），可导致急性或慢性肺部感染，尤其常见于囊性纤维化及慢性阻塞性肺疾病等基础肺病患者。该菌因细胞壁富脂、通透性低、外排系统活跃以及药物修饰灭活机制复杂，被称为“抗生素噩梦”，现有治疗方案疗效有限，治愈率较低。尽管既往研究已提示WhiB7、外排泵、药物修饰酶以及DNA旋转酶相关突变参与耐药，但Mab内在多药耐药的全局转录调控网络仍不清楚。SigH作为一种替代σ因子，在结核分枝杆菌（Mtb）和耻垢分枝杆菌中已被证实参与氧化应激、热应激和亚硝化应激反应，并受抗σ因子RshA调节，但其在Mab中的功能尚缺乏系统阐明。因此，研究人员围绕sigH开展研究，旨在明确其在抗菌药物耐受、应激适应和细胞包膜稳态中的作用，并为Mab新型治疗靶点开发提供依据。

在研究设计上，研究人员首先利用CRISPR-Cpf1辅助重组构建sigH缺失株（ΔsigH）及多种互补株、过表达株；随后采用肉汤微量稀释法和固体平板点样抑菌法评估药物敏感性，使用二酰胺（diamide）、H₂O₂和45°C热应激模型检测应激存活；通过RNA测序（RNA-seq）结合qRT-PCR进行差异表达分析，并辅以绿色荧光蛋白（GFP）报告系统评估sigH天然启动子活性；进一步采用溴化乙锭（EtBr）积累实验、扫描电子显微镜（SEM）观察细胞包膜通透性与形态变化，并进行分子对接分析。研究样本均来源于实验室菌株Mab GZ002及其构建衍生株，未涉及临床队列。

**Identification of the stress response regulator SigH in Mab**
研究人员首先从Mab中锁定相邻分布的σ因子sigH（MAB_3543c）及抗σ因子rshA（MAB_3542c）作为研究对象。结果显示，rshA缺失后药物敏感性变化不显著，而Mab SigH与Mtb SigH具有84%氨基酸同一性，提示其可能具备保守的应激调控功能。进一步实验发现，在WT中高表达sigH可显著增强对替加环素（TIG）和氟喹诺酮类（FQs）的耐受，说明SigH与耐药表型有关。

**Deletion of sigH increases Mab hypersensitivity to multiple antibiotics**
通过CRISPR/Cpf1构建的ΔsigH菌株在多药敏试验中表现出显著高敏感性，涉及核糖体靶向药物TIG、四环素（TET）、阿米卡星（AMK），细胞壁合成抑制剂万古霉素（VAN），氟喹诺酮类左氧氟沙星（LFX）和莫西沙星（MFX），以及利福布汀（RIB）。将Mab sigH或Mtb sigH导回ΔsigH后，耐药表型恢复；无论采用天然启动子（Np）还是hsp60强启动子驱动表达，均可恢复耐药性。这些结果说明SigH是Mab内在多重耐药的重要决定因子。

**Deletion of sigH influences stress responses in Mab**
针对应激生存能力的检测显示，ΔsigH对硫醇特异性氧化剂二酰胺高度敏感，抑菌圈明显大于WT和互补株。在50 mM二酰胺、50 mM H₂O₂及45°C热应激条件下，ΔsigH在8小时后的存活率均明显降低。由此可见，SigH对于Mab抵御氧化应激和热应激至关重要，这一功能与其在其他分枝杆菌中的已知作用一致。

**Transcriptomic profiling reveals differential gene expression and correlative patterns among WT, ΔsigH, and CPMabsigH strains**
RNA-seq层面的样本聚类、主成分分析（PCA）和相关性热图表明，ΔsigH与WT及互补株在全局表达谱上明显分离，提示sigH缺失导致广泛转录重编程。前30个差异基因的聚类模式也支持这一结论，说明SigH对基因表达网络具有显著影响。

**Deletion of sigH affects global gene expression in Mab**
进一步差异表达分析显示，在ΔsigH与WT比较中共检测到863个差异表达基因（DEGs），其中451个上调、372个下调，是三组比较中变化最显著的一组。多个表达显著下调的基因编码外胞质功能（ECF）抗σ因子、饥饿诱导DNA保护蛋白、替代σ因子、糖基转移酶、ABC型转运蛋白相关成分及氧化还原相关蛋白。与此同时，YrbE家族和MCE家族蛋白编码基因显著上调，而多个σ因子及抗σ因子基因明显下调。KEGG富集分析提示，ΔsigH中差异基因主要富集于ABC型转运系统；GO分析则提示σ因子活性、转运体活性、辅因子结合及跨膜转运相关功能受到显著影响。qRT-PCR验证结果与RNA-seq在上下调方向上保持一致，证明测序结果可靠。总体说明，SigH是维持Mab全局转录稳态的重要调控节点。

**Activity of the sigH promoter in WT and ΔsigH strains**
研究人员构建了天然sigH启动子（Np）驱动GFP的报告系统，以比较WT和ΔsigH中的启动子活性。结果显示，WT: Np-GFP的活体荧光强度约为ΔsigH: Np-GFP的10倍，激光共聚焦显微镜观察也显示ΔsigH中信号显著减弱。这一现象提示SigH的存在与sigH启动子更高活性相关，支持SigH可能参与自身转录调控的判断。序列比对进一步发现，一批差异表达基因预测启动子的?35区与sigH启动子存在较高一致性，为SigH可能识别这些启动子提供了间接证据，但作者同时指出仍需进一步实验验证。

**SigH contributes to drug resistance by influencing other drug resistance determinants in Mab**
转录组结果表明，ΔsigH中多个与耐药相关的基因下调，包括MAB_1362、MAB_4143c、MAB_3028、MAB_3388c（serB2）、MAB_3542c（rshA）和MAB_3016c。基于此，研究人员选取两个下调基因MAB_3388c、MAB_4143c以及一个上调基因MAB_1011c，在ΔsigH背景下进行过表达。药敏结果显示，这些过表达株均可恢复耐药表型，部分药物上的MIC甚至高于WT和互补株。该结果表明，SigH并非仅直接影响单一药物反应，而是通过调控其他耐药决定因子的表达来维持Mab对多类抗菌药物的内在耐受。

**Deletion of sigH enhanced Mab cell wall permeability**
EtBr积累实验用于评估细胞包膜通透性。与WT相比，ΔsigH细胞内EtBr荧光显著升高，说明其细胞包膜通透性增强；sigH互补后该表型可部分恢复。这一结果提示，SigH参与维持Mab细胞包膜完整性，而包膜屏障功能受损可能是ΔsigH多药高敏感的重要机制之一。

**Deletion of sigH altered bacterial growth and cell length**
在标准体外培养条件下，WT、ΔsigH和互补株在液体培养中的OD₆₀₀生长曲线相近，说明sigH缺失对总体生长速率影响有限；但菌落形成单位（CFU）计数显示，ΔsigH活菌数略有但显著下降。扫描电子显微镜进一步显示，ΔsigH细胞长度明显增加，平均长度由WT的1.19 μm增至1.46 μm，互补后部分恢复至1.25 μm。这说明SigH与细胞分裂过程或细胞包膜稳态调控有关，形态学改变与其全局应激调控功能相一致。

**Stable drug–SigH interactions revealed by molecular docking**
由于缺乏Mab SigH晶体结构，研究采用与之高度同源的Mtb SigH结构进行分子对接。结果显示，TIG、MFX、LFX和RIB与SigH的预测结合能较低，分别为?7.72、?7.87、?7.55和?8.08 kcal/mol，提示这些药物与SigH存在较稳定的潜在相互作用；而头孢西丁（CFX）结合较弱。该部分结果为解释药敏表型提供了计算层面的补充支持，但作者明确指出其生物学意义仍需进一步实验确认。

讨论部分围绕SigH作为全局性应激响应σ因子的中心地位展开。研究表明，SigH缺失不仅削弱Mab对多类抗菌药物的内在耐药性，也显著损害其在氧化、硫醇氧化和热应激下的生存能力，提示应激适应与耐药维持密切相连。转录组证据进一步显示，SigH通过调控ABC型转运蛋白、σ/抗σ因子网络、耐药相关蛋白及细胞包膜相关基因，共同塑造Mab的耐药和适应性表型。与此同时，ΔsigH中YrbE与MCE家族蛋白上调，提示细菌在SigH缺失后可能启动代偿性应答，但这一代偿不足以恢复野生型水平的耐药性。EtBr积累增加和细胞延长现象共同支持SigH参与维持细胞包膜完整性与细胞形态稳态。总体上，该研究将SigH界定为连接“应激适应—包膜稳态—多药耐药”的关键调控枢纽，为抗Mab药物开发提供了新的切入点。

研究结论部分可概括为：SigH在Mab中参与应激应答与多重耐药调控。sigH缺失会导致多种耐药决定因子下调、细胞壁通透性增加、应激耐受受损，并增强对多类抗菌药物的敏感性。转录组学与功能学分析表明，SigH协调由外排转运体、应激反应基因及耐药相关蛋白构成的广泛调控网络。抑制SigH或破坏其调控相互作用，可能成为克服Mab内在耐药性的一种新策略。此外，细菌可能通过上调YrbE和MCE家族蛋白等方式对该下调网络进行代偿。尽管部分机制仍需进一步实验证实，但本研究为将SigH确立为Mab潜在药物靶点奠定了基础。