肠杆菌属（Enterobacter）分离株的基因组特征揭示了ST78高风险克隆的广泛传播及blaNDM-1的质粒介导传播

《Microbiology Spectrum》：Genomic characterization of Enterobacter isolates highlights widespread ST78 high-risk clone and plasmid-mediated dissemination of blaNDM-1

　　

本研究对2020年至2024年间在墨西哥14个联邦实体收集的肠杆菌属（Enterobacter）临床分离株进行了全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）。亚种水平的鉴定结果显示，霍氏肠杆菌霍氏亚种（Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii）和霍氏肠杆菌香坊亚种（E. hormaechei subsp. xiangfangensis）占主导地位，后者对测试抗菌药物的耐药率最高。耐药组（Resistome）分析鉴定出bla_NDM-1是碳青霉烯耐药分离株中最常见的碳青霉烯酶。可移动组（Mobilome）分析显示，bla_NDM-1主要由IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272型质粒携带。与公共基因组的系统基因组比较结合bla_NDM-1的优势分布，提示了跨大陆传播。值得注意的是，研究鉴定了霍氏肠杆菌亚种的国际克隆，如ST182和ST78，以及区域相关克隆如ST92、ST45、ST116和ST93。最后，基因组证据支持存在一个与布甘达肠杆菌（Enterobacter bugandensis）、线虫肠杆菌（E. nematophilus）和川大肠杆菌（E. chuandaensis）相关的推定新型肠杆菌属物种。

肠杆菌属细菌因其获取和传播抗菌药物耐药性的能力而对全球公共卫生构成严重威胁。目前，墨西哥缺乏肠杆菌属的基因组监测数据，这限制了对该国分子流行病学及其与全球趋势联系的理解。本研究发表在《Microbiology Spectrum》上，首次提供了墨西哥全国肠杆菌属的基因组概览，揭示了地方性传播和广泛传播的克隆，包括已识别的高风险谱系以及bla_NDM的传播。此外，研究还描述了一个推定的新型物种，并通过公开基因组数据为监测、暴发检测和控制肠杆菌属抗菌药物耐药性的策略提供了重要数据支撑。

研究人员开展了一项全国性、多中心的基因组监测研究，收集了2020年至2024年间来自墨西哥24家医疗机构的122株多重耐药肠杆菌属临床分离株，这些分离株来源于INVIFAR网络覆盖的14个联邦实体。研究旨在通过全基因组测序阐明墨西哥肠杆菌属的物种分布、分子流行病学、耐药机制、毒力特征及克隆动态。

研究所采用的主要关键技术方法包括：基于VITEK 2系统和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的物种鉴定与药敏测试；使用Illumina NextSeq 550平台进行鸟枪法全基因组测序；运用Fastp进行质量控制、Unicycler进行从头组装、QUAST和CheckM评估组装质量；采用平均核苷酸一致性（ANI）、核心基因组系统发育、核糖体多位点序列分型（rMLST）及Type Strain Genome Server（TYGS）进行物种鉴定；通过PubMLST数据库进行多位点序列分型（MLST）及goeBURST分析；利用ABRicate结合CARD和VFDB数据库进行耐药组、毒力组分析；使用Mobile Element Finder和MOB-suite进行可移动遗传元件及质粒分析；通过Panaroo构建泛基因组、IQ-TREE进行最大似然法系统发育分析；并与NCBI RefSeq数据库中7909个公共基因组进行比对分析。

研究结果部分：

一、临床分离株与样本来源。122株分离株来自多种临床来源，分为侵袭性样本（血液、活检、引流液、脑脊液、脓肿、胸腔积液，共43株）和非侵袭性样本（尿液、下呼吸道样本、伤口及其他，共79株）。

二、基因组组装与物种鉴定。组装基因组平均完整性为99.65%，平均污染率0.64%。四株分离株（20-2045、20-2046、20-2065、20-2064）因ANI值约95%、与线虫肠杆菌关系密切但核心基因组系统发育和TYGS分析将其归为独立分支，被推定为肠杆菌属新型物种。16株原鉴定为霍氏肠杆菌霍夫曼亚种（E. hormaechei subsp. hoffmannii）的分离株与肠居肠杆菌（E. intestinihominis）聚类，研究将其归入霍氏肠杆菌霍夫曼亚种。霍氏肠杆菌（n=99）为最常见物种，各亚种分布为：霍氏肠杆菌施泰格尔瓦尔蒂亚种（n=40）、香坊亚种（n=39）、霍夫曼亚种（n=16）、霍氏亚种（n=3）和大原亚种（n=1）。其他物种包括阴沟肠杆菌（n=6）、阿斯布肠杆菌（n=5）、罗根坎普肠/cluster_2272型质粒携带bla_NDM-1。这些质粒携带单独的bla_NDM-1，与霍氏肠杆菌香坊亚种ST182（10/11）和ST92（9/9）显著相关（P<0.01）。ST182-IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272分离株分布于墨西哥中部四个城市，而ST92分离株限于哈利斯科州单一医疗机构。共线性分析显示这些质粒具有保守骨架和相似组织结构，与肺炎克雷伯菌质粒pCRE14最为相似。

七、包含公共基因组的系统发育分析。与7909个公共基因组的比较显示：霍氏肠杆菌施泰格尔瓦尔蒂亚种分支包含126个基因组，其中40个来自亚洲、25个来自欧洲、11个来自北美；霍氏肠杆菌香坊亚种分支中，ST182与墨西哥、南美洲和欧洲基因组聚类，ST92形成独立分支；霍氏肠杆菌霍夫曼亚种ST78与主要来自欧洲的基因组聚类；推定新型物种中三株与亚洲基因组关系最近，一株与北美 isolates相关。

讨论部分：

准确的ECC物种水平鉴定至关重要，因为不同成员在致病性和耐药性上存在差异。本研究中霍氏肠杆菌为优势物种，各亚种分布与亚洲和欧洲报告一致。研究鉴定出一个与布甘达肠杆菌、线虫肠杆菌和川大肠杆菌相关的推定新型物种。此外，分析表明霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与肠居肠杆菌可能代表同一物种，两者ANI约99%且在系统基因组分析中聚类，因此肠居肠杆菌应被视为霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的同义名而非独立物种。虽然ANI是物种鉴定的可靠指标，但低基因组分化类群可能偏离常规的95%-96%阈值，此时核心基因组和全基因组系统发育分析提供最可靠的鉴定方法。

本研究中耐广谱β-内酰胺类抗生素分离株比例超过50%，高于亚洲报告，但需注意INVIFAR网络的监测号召针对多重耐药菌，可能引入选择偏倚。碳青霉烯耐药率达45%，是大型监测研究（约10%）的四倍以上，且与bla_NDM-1相关。多数美洲研究报告bla_KPC为主，而本研究以bla_NDM为主，提示跨大陆传播的可能性，尽管这一假设受限于美洲近年缺乏大规模研究。系统发育分析显示与美国公共基因组相似度低的支持了这一解释。黏菌素耐药率为10%，低于其他研究报道的20%-70%；仅一株mcr阳性分离株表现为黏菌素耐药，而八株mcr阳性但非耐药，提示可能存在独立于mcr的耐药机制，如arn操纵子或其调控因子phoPQ和mgrB的突变导致脂质A修饰。值得注意的是，推定新型物种的所有分离株均对黏菌素耐药，机制不明。

霍氏肠杆菌亚种虽具有更高的分离频率、耐药率和bla_NDM-1频率，但黏菌素耐药仅见于其中一株。相反，黏菌素耐药见于阴沟肠杆菌、阿斯布肠杆菌、罗根坎普肠杆菌、神户肠杆菌和推定新型物种，这可能反映了耐药克隆的传播，特别是阴沟肠杆菌ST456和推定新型物种表现出强系统发育相关性。

霍氏肠杆菌施泰格尔瓦尔蒂亚种包含16个不同ST和5个新型ST，ST93、ST45和ST116最常见。ST93仅源于索诺拉州北部墨西哥的两家医疗机构，虽是国际广泛传播的bla_NDM-1相关克隆，但本研究中对应分离株对碳青霉烯敏感。ST45在墨西哥五个不同城市传播，此前曾在哥伦比亚、智利和阿根廷作为bla_KPC携带者报道。ST116缺乏碳青霉烯酶，在墨西哥四个不同城市传播，主要见于亚洲研究。ST92限于索诺拉州北部，可能提示该克隆的暴发。

霍氏肠杆菌香坊亚种中最常见的ST182包含11株分离株，分布于墨西哥中部六个不同医疗机构。ST182被确认为流行病学新兴谱系，常与携带IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272型质粒的bla_NDM相关，此前在欧洲有报道。2015年墨西哥曾有ST182携带bla_NDM-1（位于IncFII质粒）的报告。系统发育分析显示本研究所有ST182分离株关系密切，尽管地理来源分散；与公共基因组比较显示与一株墨西哥分离株和南美洲分离株近缘。第二常见的ST92限于哈利斯科州单一医疗机构，分离株系统发育距离接近零，均携带bla_NDM-1 IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272质粒，此前少见报道且多与bla_VIM相关，本研究提示可能存在局限于单一医疗机构/城市的ST92暴发。

霍氏肠杆菌霍夫曼亚种表现为ST78的克隆分布，13株分离株于2020年至2024年间分布于墨西哥北部、中部和南部城市，来自八个不同医疗机构，部分菌株携带IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272 bla_NDM-1质粒。ST78是2008-2014年收集研究中已报道的高风险、产ESBL国际克隆，此后在欧洲和美洲均有报告，与公共基因组的系统发育分析一致。阴沟肠杆菌ST456是最常见的ST，四株分离株来自同一城市的两个医疗机构，其中三株对黏菌素耐药且缺乏mcr基因，此前少有报道且未与黏菌素耐药相关。

耐药基因含量分析识别出两个主要聚类：高耐药基因频率聚类包括霍氏肠杆菌霍夫曼亚种、香坊亚种和施泰格尔瓦尔蒂亚种，可能解释其频繁分离并强调其获取耐药决定簇的潜力。毒力基因含量分析仅显示微小差异，最显著的是霍氏肠杆菌施泰格尔瓦尔蒂亚种中铁获取基因的存在，提示所鉴定的毒力基因可能代表临床环境中生存所必需的基础毒力决定簇。

IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272质粒是与bla_NDM-1相关的主要移动元件，具有保守结构，分布于墨西哥中部五个城市和北部一个城市、八个不同医疗机构。其接合性质由存在于五种不同ECC物种中得以证实。

短读长测序虽非质粒重建的金标准，MOB-suite旨在于此局限性，对质粒检测敏感性高（约95%）但检测新质粒能力有限。长读长测序建议在需要完整质粒组装时采用。本研究使用80%覆盖度阈值并通过BLAST比对验证，获得了高覆盖度值。

研究存在以下局限性：未探索mcr基因以外的黏菌素耐药机制（如LPS修饰的表型证据）；未进行毒力分析的表型测试，因此关于毒力组临床相关性的解释应谨慎；霍氏肠杆菌亚种在数据集中过度代表，反映了采样群体中ECC物种的自然分布；短读长测序限制了完整质粒重建，尽管研究人员利用了未映射读长组装方法来重建这些序列。

研究结论：

在纳入的分离株中，霍氏肠杆菌是最常鉴定的物种，其中霍氏肠杆菌香坊亚种、施泰格尔瓦尔蒂亚种和霍夫曼亚种为优势亚种。霍氏肠杆菌香坊亚种表现出更高的总体耐药率。系统发育分析和bla_NDM-1的分布提示跨大陆传播。霍氏肠杆菌香坊亚种中发现了广泛传播（ST182）和局部化（ST92）的序列型；类似地，霍氏肠杆菌施泰格尔瓦尔蒂亚种包括广泛传播（ST45和ST116）和局部化（ST93）克隆；霍氏肠杆菌霍夫曼亚种由广泛传播的高风险ST78克隆代表。检测到的主要超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶基因分别为bla_CTX-M-15和bla_NDM-1，两者均与质粒相关，后者与IncFIB/IncFII/rep_cluster_2272复制子类型相关。基于基因组证据，研究人员提出将肠居肠杆菌作为霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的同义名。最后，研究人员描述了肠杆菌属中的一个推定新型物种。