婴儿双歧杆菌和母乳低聚糖在无菌小鼠模型中对免疫反应和氨基酸代谢具有独立和协同效应

《mSystems》：Bifidobacteria infantis and human milk oligosaccharides have independent and synergistic effects on immune response and amino acid metabolism in germ-free mouse models

　　

生命早期的微生物定殖对肠道和免疫发育至关重要。母乳低聚糖（HMOs）支持婴儿双歧杆菌（BI）的生长。在此，研究人员研究了BI和HMOs单独及联合对免疫和结肠转录组以及血清和盲肠代谢组的影响。无菌小鼠被随机分配到四组（每组10-14只：HMO组、BI组、BI+HMO组和对照组[无HMO或BI]）。HMO组和BI+HMO组每天接受5 mg的2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖和3′-唾液酸乳糖，持续14天。BI组和BI+HMO组在第1、4和9天接受BI ATCC 15697（1×10⁹ CFU/天）。与对照组相比，单一定殖BI增加了肠系膜淋巴结（MLN）中的单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺ T细胞和Treg细胞。在脾脏中，仅BI增加了B细胞、树突状细胞、Th17细胞和ILC3细胞，并丰富了血清氨基酸代谢通路。此外，BI影响了结肠细胞基因表达并调节了调节昼夜节律的血清代谢物。与单独HMO相比，BI+HMO增加了MLN Th17细胞和脾脏单核细胞。总体而言，本研究结果突出了宿主-微生物-膳食相互作用的复杂关系，并强调了在设计调节婴儿早期健康策略时考虑这些相互作用的重要性。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

生命早期的微生物定殖对肠道和免疫系统的发育至关重要。母乳含有多种生物活性成分，其中母乳低聚糖（HMOs）是母乳中第三大固体成分，超过150种不同结构，以2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）和乳糖-N-四糖（LNT）等含量最高。HMOs不仅可作为益生元选择性地促进特定双歧杆菌属的生长，还具有直接调节免疫的功能。婴儿双歧杆菌（BI）拥有独特的酶系统，能高效摄取和胞内代谢HMOs，在母乳喂养婴儿肠道中具竞争优势。尽管BI和HMOs各自对宿主的作用已有报道，但两者在免疫系统和代谢过程中的独立与协同效应尚未被充分阐明。特别是缺乏在无其他微生物干扰下，系统剖析BI与HMO交互作用对宿主免疫细胞组成、代谢通路及基因表达影响的研究。

**研究人员开展的研究及结论**

无菌小鼠被随机分为四组（每组10-14只）：对照组（PBS）、HMO组（2′-FL、LNT和3′-SL混合物，15 mg/天，14天）、BI组（BI ATCC 15697，1×10⁹ CFU/天，第1、4、9天）和BI+HMO组（同时接受HMO和BI）。通过流式细胞术评估脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）免疫细胞组成；通过单细胞RNA测序分析结肠组织转录组；通过靶向代谢组学分析血清和盲肠代谢物。结果显示：BI单独定殖显著增加了MLN中单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺ T细胞和Treg细胞，以及脾脏中B细胞、树突状细胞、Th17细胞和ILC3细胞，同时富集了血清氨基酸代谢通路并调节了昼夜节律相关基因表达（如Per1、Per2、Per3）。HMO单独处理主要降低了MLN Th1细胞比例。BI+HMO联合处理产生了独特的非叠加效应，如增加了MLN Th17细胞和脾脏单核细胞，并改变了45种血清代谢物（富集乙醛酸和二羧酸代谢及柠檬酸循环通路）。此外，BI调节了结肠细胞中氨基酸转运和昼夜节律相关生物学过程。该研究发表《mSystems》，强调了宿主-微生物-膳食相互作用在婴儿早期健康中的重要性。

**主要关键技术与方法**

研究人员采用无菌小鼠模型（C57BL/6J，断奶后21天）进行体内实验。主要技术方法包括：（1）流式细胞术分析脾脏和MLN免疫细胞亚群；（2）单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析结肠组织细胞转录组；（3）靶向代谢组学（覆盖600种代谢物/基质）检测血清和盲肠代谢物谱；（4）通过KEGG通路富集分析（MetaboAnalyst 6.0）鉴定代谢通路；（5）采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验评估BI和HMO的主效应及交互效应。样本来源为无特定病原体（SPF）条件下繁殖的无菌小鼠。

**研究结果**

**1. BI补充影响脾脏、肝脏、盲肠重量和回肠隐窝深度**

与未接受BI的小鼠（HMO组和对照组）相比，BI组和BI+HMO组的脾脏和肝脏重量（占体重百分比）显著增加。盲肠重量受BI和HMO双重影响：接受BI的小鼠盲肠重量降低，而接受HMO的小鼠盲肠重量增加。仅回肠隐窝深度在BI组中显著增加，提示BI直接影响肠道形态。

**2. BI塑造脾脏和MLN免疫细胞组成**

通过流式细胞术分析，在MLN中，与未接受BI的小鼠相比，BI组单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和Treg细胞比例升高，中性粒细胞比例降低。HMO仅降低MLN Th1细胞比例。BI×HMO交互作用影响MLN Th2和Th17细胞：BI组Th2比例最高，而HMO组Th17比例低于BI+HMO组和对照组。在脾脏中，BI增加树突状细胞、B细胞、Th17细胞和ILC3比例；HMO降低单核细胞比例；BI+HMO组脾脏单核细胞比例高于HMO组。

**3. 结肠单细胞转录组学**

单细胞RNA测序分析显示，BI组结肠隐窝深部分泌细胞（deep crypt secretory cells）相对丰度增加，而HMO组增殖性过渡放大细胞（TA细胞）相对丰度增加。在非上皮细胞中，BI组ILC1丰度高于BI+HMO组，ILC2丰度低于BI+HMO组。通路富集分析表明，BI组结肠细胞中氨基酸跨膜转运、氨基酸导入、中性氨基酸转运等生物学过程富集，同时昼夜节律调控（entrainment of circadian clock）过程富集。差异基因表达分析显示，BI调控了13种不同细胞亚型中昼夜节律相关基因（Per1、Per2、Per3、Ciart、Dbp、Nr1d2）的表达。

**4. BI影响血清和盲肠代谢谱**

血清代谢组学分析发现，BI显著改变了318种代谢物，其中219种升高，99种降低。升高的代谢物富集于丁酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸/脯氨酸代谢、叶酸一碳单位代谢、鞘脂代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成和组氨酸代谢通路。同时，BI降低了血清中甘油三酯、二酰甘油和胆固醇酯水平。HMO改变了147种血清代谢物，其中104种降低（富集于三种氨基酸代谢通路），43种升高（以甘油三酯为主）。值得注意的是，BI和HMO对氨基酸代谢通路的调节方向相反（BI上调，HMO下调）。BI×HMO交互作用影响了45种血清代谢物，其中42种在BI+HMO组低于BI组，富集于乙醛酸和二羧酸代谢及柠檬酸循环。盲肠代谢组中，BI改变了23种代谢物（14种降低，9种升高），降低的代谢物富集于甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路（边缘显著，FDR=0.07）。HMO仅影响6种盲肠代谢物，未检测到BI×HMO交互效应。

**讨论与结论**

本研究系统揭示了在无菌小鼠模型中，BI和HMO对免疫系统、结肠转录组和代谢组的独立与协同效应。BI单一定殖即可驱动广泛的免疫调节（增加MLN和脾脏多种免疫细胞比例）和代谢重编程（富集氨基酸代谢、降低甘油三酯），并影响昼夜节律基因表达。HMO主要通过直接免疫调节（降低MLN Th1）和反向调节BI诱导的氨基酸代谢变化。BI+HMO联合处理产生了独特的非叠加效应，特别是对MLN Th1/Th2/Th17平衡、ILC1/ILC2比例以及血清代谢物谱（尤其乙醛酸和柠檬酸循环）的调节，提示HMO存在时BI的代谢适应从糖酵解转向发酵途径。

**研究结论：** 与HMO补充和BI×HMO交互作用相比，单一定殖BI在不同器官位点引发了不同的宿主反应。一个可能的原因是无菌小鼠模型缺乏竞争性微生物群，可能使BI能够定殖并强力驱动代谢和免疫调节结果。虽然BI和HMO对宿主反应产生不同的影响，但BI×HMO交互作用诱导了独特的非叠加宿主反应，突出了微生物群和饮食相互作用对宿主健康的复杂性。总体而言，本研究结果强调了在设计调节婴儿早期健康策略时考虑宿主-微生物-膳食相互作用效应的重要性。