利用多模态SERS和RNA-Seq技术对正常体重及超重2型糖尿病患者的血浆细胞外囊泡进行分析

《Diabetes Research and Clinical Practice》：Analysis of plasma extracellular vesicles in normal-weight and overweight type 2 diabetes mellitus using multimodal SERS and RNA-Seq

　　

乌古尔·帕尔拉坦|阿扬·尼勒什·帕特尔|胡利亚·托伦|阿斯玛·胡迈拉·卡里姆|梅赫梅特·奥兹根·奥曾|拉塔·帕拉尼亚潘|乌特坎·德米尔奇

生物声学MEMS在医学中的应用，斯坦福大学医学院放射科金丝雀中心BAMM实验室，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市

摘要

研究目的

在临床分层的队列中，利用细胞外囊泡相关的分子特征，分析2型糖尿病中的亚型相关异质性，尤其是正常体重糖尿病患者的特征。

研究方法

通过ExoTIC技术从血浆中分离出富含细胞外囊泡的样本，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析、流式细胞术和西方印迹法进行验证。对亚洲正常体重、亚洲超重、非西班牙裔白人正常体重以及非西班牙裔白人超重的2型糖尿病患者所提取的富含细胞外囊泡的样本，分别采用多模态表面增强拉曼光谱（n=65）和细胞外囊泡RNA测序（n=39）进行分析。

研究结果

表面增强拉曼光谱检测到在该队列中，不同BMI及种族/民族分组之间存在与亚型相关的光谱差异。细胞外囊泡RNA测序则发现了差异性的微小RNA表达模式：亚洲超重组中miR-208a和miR-132的水平较高，而亚洲正常体重组中miR-484的水平较高，这些分子可能是未来研究的重点对象。无监督分析还显示，亚洲正常体重组和非西班牙裔白人超重组的细胞外囊泡相关分子特征存在部分重叠，这说明统一的BMI阈值可能无法完全反映不同人群中的细胞外囊泡分子异质性。

研究结论

多模态细胞外囊泡分析方法能够在临床分层的2型糖尿病患者中识别出与亚型相关的光谱特征及微小RNA特征，为研究糖尿病的异质性提供了框架，也包括与正常体重糖尿病相关的分子模式。

引言

细胞外囊泡作为一种代谢信号传递的介质，同时也是2型糖尿病疾病异质性的潜在标志物，全球约有5.89亿人患有此病[1]。尽管2型糖尿病存在临床上的异质性[2]，目前的分类系统主要依据身体质量指数来划分，而忽视了在分子层面存在差异的正常体重糖尿病现象——这类患者占2型糖尿病患者的20%，且其死亡风险反而高于超重或肥胖的2型糖尿病患者[3][4]。这种正常体重糖尿病在亚洲人群中更为常见，他们患2型糖尿病的BMI阈值低于其他种族群体，但导致这些种族和BMI差异的细胞外囊泡相关分子特征至今尚未被明确界定[5][6][7]。由于不同祖先群体的BMI阈值可能存在差异，我们在分析时需要结合与祖先相关的身体成分和糖尿病风险差异来理解基于BMI的分类结果。

细胞外囊泡能够促进胰岛素敏感组织之间的通讯，它们携带包括微小RNA、蛋白质和脂质在内的生物活性物质[8][9]，这些物质反映了它们的来源细胞，并能调节接收细胞的代谢功能[10][11][12]。在2型糖尿病中，来自脂肪组织[13]、肝脏[14]和胰腺组织[15]的循环细胞外囊泡带有特定的微小RNA特征，如miR-208a、miR-132和miR-484，这些微小RNA能够调控胰岛素信号传导[16][17][18]、线粒体功能[19]以及β细胞的功能[20]。不过，目前的细胞外囊泡分析方法通常仅通过测序分析其携带的成分[21][22]，或通过光谱学分析其表面生物化学特性[23][24][25][26]，无法全面了解其特性。

表面增强拉曼光谱能够无需标记即可对完整的细胞外囊泡进行光谱特征分析，从而了解其蛋白质、脂质和糖基化特征，而RNA测序则可以揭示其中的调控性物质[26][27]。将表面增强拉曼光谱与RNA测序相结合，就可以在同一份富含细胞外囊泡的样本中同时分析其光谱特征和微小RNA组成。这种方法通过结合表面特征和内容物分析，能够更全面地了解2型糖尿病的分子和光谱异质性，也避免了单一分析方法无法建立这种关联的局限性。虽然以往的研究分别探讨了不同BMI类别或不同种族/民族群体中的细胞外囊泡蛋白标记物，但目前尚无研究同时运用多模态表面增强拉曼光谱和RNA测序，来分析不同种族和BMI分组中的细胞外囊泡的无标记生化特征和分子组成。

为填补这一空白，我们提出假设：不同种族背景下的正常体重和超重2型糖尿病患者的血浆细胞外囊泡携带的分子特征存在差异，这些差异反映了二者之间的病理生理差异。考虑到研究队列的构成以及研究亚洲人群中正常体重糖尿病的必要性，我们决定以种族内的比较作为主要分析对象，尤其是亚洲队列内的比较，而将跨组比较视为次要的群体层面观察结果。本研究通过多模态表面增强拉曼光谱和微小RNA测序，分析了按BMI和种族/民族分组的65名2型糖尿病患者的血浆细胞外囊泡特征。如图1所示，在对细胞外囊泡进行验证后，表面增强拉曼光谱分析发现了基于脂质和蛋白质特征的不同2型糖尿病亚型光谱特征，而RNA测序则发现了不同的微小RNA表达模式：超重患者中miR-208a和miR-132的表达水平升高，而正常体重患者中miR-484的表达水平升高，这提示胰岛素信号传导和线粒体生物学可能是解释这些特征的关键因素。尽管亚洲正常体重组和非西班牙裔白人超重组的BMI有所不同，但他们的细胞外囊泡分子特征却较为相似，这说明针对不同人群设定的BMI阈值可能会掩盖该队列中存在的共同细胞外囊泡相关分子模式。这种多模态细胞外囊泡分析策略有助于全面解读不同临床分组中的细胞外囊泡光谱特征和微小RNA特征。

章节节选

研究结果

首先，我们按照MISEV2023指南[28]对从血浆中分离出的细胞外囊泡进行了鉴定，分析了它们的大小分布、形态以及蛋白质标记物（见图2）。为了通过已有报道的四跨膜蛋白标记物确定细胞外囊泡的身份[28][29]，我们采用了珠子捕获流式细胞术和西方印迹法进行分析。流式细胞术结果显示，这些细胞外囊泡的CD63阳性率很高，分别为97.8%和95.9%（见图2），HSPA8标记率为69.3%，而钙网蛋白的信号则很低，仅为9.3%（见图2），这说明

讨论

本研究弥补了糖尿病异质性研究中的不足，表明血浆中的细胞外囊泡相关指标能够反映出临床参数无法显示的与种族/民族及BMI相关的分子特征。研究共有三个重要发现：（1）表面增强拉曼光谱分析发现了富含细胞外囊泡的样本中与不同亚型相关的光谱差异；（2）RNA测序在亚洲正常体重糖尿病组与超重组之间发现了具有潜在意义的微小RNA差异；（3）亚洲正常体重糖尿病组和非西班牙裔白人超重组之间的细胞外囊泡相关特征存在部分重叠

研究结论

这些研究结果表明，通过分析血浆中的细胞外囊泡特征，可以揭示2型糖尿病中仅通过BMI无法发现的群体层面的分子特征，比如本研究中亚洲正常体重糖尿病患者与非西班牙裔白人超重患者在表面增强拉曼光谱和RNA特征上存在相似性。从各种分析方法来看，所观察到的细胞外囊泡相关光谱特征以及与不同亚型相关的微小RNA模式，都可以被视为群体层面的分子描述指标，有望为未来进一步研究2型糖尿病的异质性提供帮助

血浆样本采集与细胞外囊泡的分离

本研究共收集了65名受试者的外周血样本，其中40名属于超重组，25名属于正常体重组，所有采样工作均按照机构审查委员会的批准方案进行。研究对象的详细基线信息，包括年龄、性别、种族/民族、BMI以及HbA1c水平，详见补充表1。血液样本在采集后两小时内进行处理。首先通过1,500克/力的离心作用分离出血浆，持续10分钟，以去除细胞成分，之后再以10,000克/力的离心力进一步分离

数据可用性

支持本研究结果的所有数据均包含在论文及其补充材料中。用于生成图2、图3及相关数据的自定义代码已上传至Zenodo平台，其标识符为https://doi.org/10.5281/zenodo.18945379 [49]。如有需要，相应作者也可提供更多支持本研究结果的数据。

此外，还有其他支持本研究结果的数据，可在合理请求下从相应作者处获取。

关于 manuscript准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写本文的过程中，作者们使用了ChatGPT来优化文本的表达流畅度。在使用该工具后，作者们对内容进行了必要的审核和修改，并对最终发表的文章内容负全责。

CRediT作者贡献说明

乌古尔·帕尔拉坦：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，软件使用，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理，概念构建。阿扬·尼勒什·帕特尔：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，软件使用，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理。胡利亚·托伦：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，方法设计，研究实施，正式分析，数据

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：乌特坎·德米尔奇表示获得了斯坦福大学糖尿病研究中心的财政资助；拉塔·帕拉尼亚潘表示获得了美国国立卫生研究院的财政支持。乌特坎·德米尔奇还与Vetmotl, Inc.存在关联，包括担任该公司董事会成员以及持有该公司股票；此外，他還与Levitasbio, Inc.存在业务往来。

致谢

U.D.感谢斯坦福大学糖尿病研究中心提供的启动资金支持。L.P.则感谢美国国立卫生研究院的资助，项目编号为1K24HL150476。我们还要特别感谢Suraj Pavagada在辅助进行BMI类别分类分析以及制作补充图6方面所提供的帮助。