在大肠杆菌中高效表达全长人类CYP2E1：全长人类CYP2E1与截短版本相比，与氧化还原伴侣的结合能力更强

《Drug Metabolism and Disposition》：High-level expression of full-length human CYP2E1 in E. coli: Comparison of full-length human CYP2E1 to truncated counterpart shows enhanced association with redox partners

　　

孙玉东|普拉文·阿穆努加马|大泽洋一|张浩明

密歇根大学医学院药理学系，密歇根州安阿伯市，邮编48109

摘要

目前仅有少数肝脏微粒体细胞色素P450（CYPs或P450s），尤其是人类P450s，能在细菌中以全长蛋白的形式被重组表达。由于缺乏N端膜锚定结构，难以研究微粒体P450s与氧化还原伴侣之间的相互作用。本文报道了在细菌中成功表达全长人类CYP2E1，将其命名为hCYP2E1FLAL，其表达产量约为704纳摩尔/升培养液。这一高表达水平得益于所采用的密码子优化策略以及适宜的生长温度，这些措施降低了翻译过程的自由能。通过单次亲和层析纯化得到的hCYP2E1FLAL不含无活性的P420形式。与N端截短的人类CYP2E1（hCYP2E1dH）相比，hCYP2E1FLAL在缺乏细胞色素b5的情况下，对典型底物氯唑唑酮和对硝基苯酚的酶活性显著提高，k_cat值大约增加了一倍。而在存在细胞色素b5时，其酶活性提升更为明显，氯唑唑酮的活性增加了4.3倍，对硝基苯酚的活性增加了2.5倍。此外，hCYP2E1FLAL与NADPH依赖型细胞色素P450氧化还原酶（POR）的结合更紧密，表观K_M值为0.36±0.026微摩尔，而截短的hCYP2E1dH的该值为1.2±0.13微摩尔。有趣的是，细胞色素b5的存在进一步降低了hCYP2E1FLAL与POR的K_M值，为0.13±0.014微摩尔，而hCYP2E1dH的该值为0.40±0.041微摩尔，这表明细胞色素b5有助于促进CYP2E1与POR的相互作用。综合这些结果可知，N端跨膜锚定结构能够增强hCYP2E1催化的反应，可能是通过与POR和细胞色素b5形成稳定的活性复合物来实现的，因此全长酶形式更适合用于进一步研究膜系统中的氧化还原伴侣相互作用。

章节节选

1. 引言

人类细胞色素P450 CYP2E1（hCYP2E1）可被酒精诱导表达，在外源性物质包括药物、毒素和致癌物的氧化转化过程中起着关键作用。hCYP2E1对N-亚硝胺、酒精和卤代烃等毒素及致癌物的代谢活化与癌症和肝脏疾病密切相关，这一事实推动了人们对CYP2E1介导的生物转化过程的研究^1,2。微粒体CYP2E1与内质网膜相连接

2. 材料与方法

2.1. 化学试剂与细胞培养。本研究使用的所有化学试剂和溶剂均为ACS等级及以上产品。CYP2E1的底物对硝基苯酚（p-NP）、氯唑唑酮（CLZ）以及相应的代谢产物4-硝基邻苯二酚（4-NC）和6-羟基氯唑唑酮（6-HC）均购自Sigma Aldrich公司（密苏里州圣路易斯市）。苯甲磺酰氟（PMSF）和氯霉素也来自Sigma Aldrich公司。磷脂1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DLPC）则购自Avanti公司

3. 结果与讨论

3.1. hCYP2E1的克隆、过表达与纯化。重组全长rCYP2E1可在pLW载体支持的E. coli C41(DE3)菌株中高效表达²¹。尽管rCYP2E1与我们的目标蛋白序列同源性约为80%，但最初尝试在pLW-C41(DE3)系统中表达全长天然hCYP2E1时并未成功，无论是否添加分子伴侣GroEL/ES，都无法检测到该蛋白的表达（数据未显示）。对CYP2E1 N端序列（1-31号残基）的分析显示，其相似度相对较低

未引用参考文献

18.; 18..

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

CRediT作者贡献说明

孙玉东：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，方法学，实验研究，正式分析，数据整理。普拉文·阿穆努加马：方法学，正式分析，数据整理。大泽洋一：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，资源提供，资金获取。张浩明：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，监督指导，资源提供，项目管理，资金获取，概念设计。

致谢

我们感谢密歇根大学的Paul Hollenberg博士，他提供了用于过表达截短型hCYP2E1dH的质粒。

资金支持

本研究部分得到了美国国家卫生研究院（编号GM153714）的资助，以及密歇根大学医学院提供的生物医学研究委员会（编号BMRC）的过渡性资助。