利用原代人肝细胞球状体探究唑类抗真菌药致药物性肝损伤生物标志物的研究

《Drug Metabolism and Disposition》：Investigation of biomarkers for azole antifungal-induced liver injury using primary human hepatocyte spheroids

　　

药物性肝损伤（Drug-induced liver injury, DILI）是临床实践中最严重的药品不良反应之一，也是药物开发阶段毒性评价的重点关切问题。特别是抗真菌药所致DILI在重症病例中可危及生命，因此早期发现和适当干预至关重要。本研究通过对非靶向代谢组学分析唑类抗真菌药暴露下原代人肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）三维球状体（spheroid）培养上清液，探索唑类抗真菌药诱导DILI的潜在早期生物标志物。研究人员将来源于两名不同供者的PHHs独立进行三维球状体培养，并予以九种抗真菌药处理。收集培养上清液并进行非靶向代谢组学分析；采样时间点依据细胞活力纵向评估确定，选取可观察到浓度依赖性细胞毒性的最晚时间点进行分析。同时检测上清液中常规肝损伤标志物——天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）水平，并于上清液采集时评估细胞活力。结果鉴定出若干与肝毒性相关的候选生物标志物，而包括AST和ALT在内的常规肝损伤标志物未见明显的浓度依赖性变化。其中一化合物经与标准品比对鉴定为甘氨胆酸（Glycocholic Acid, GCA）；正离子模式下检出的另一代谢物未能最终确证，需进一步表征。上述发现支持开发新型DILI早期检测生物标志物，并凸显其在药物开发毒性筛选及临床生物标志物研究中的应用潜力。

利用原代人肝细胞球状体探究唑类抗真菌药致药物性肝损伤生物标志物的研究——论文解读

药物性肝损伤（Drug-induced liver injury, DILI）是临床严重的药品不良反应，也是新药研发失败及上市后撤市的主要原因之一，尤其唑类（azole）抗真菌药具有一定DILI风险。目前临床常用的DILI检测标志物——天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）与丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）缺乏足够特异性与早期敏感性，且二维培养的原代人肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）会快速丢失肝特异性表型。三维PHH球状体（spheroid）能更好维持肝细胞转录组、蛋白组及代谢组特征，更接近人体肝脏生理状态。为此，研究人员利用三维PHH球状体结合非靶向代谢组学，探索唑类抗真菌药致DILI的早期细胞外生物标志物，并与AST、ALT检测灵敏度进行比较，以期为新药毒性筛查及临床早期DILI检测提供新依据。本文发表于《Drug Metabolism and Disposition》。

主要关键技术方法：

研究人员采用两名供者（一男一女）来源的PHHs进行三维球状体培养，分别予以9种唑类抗真菌药（voriconazole、fluconazole、itraconazole、ravuconazole、isavuconazole、posaconazole、ketoconazole、miconazole、oteseconazole）梯度浓度暴露；通过CellTiter-Glo 3D检测细胞内ATP评估细胞活力以确定采样点，Wako transaminase试剂盒测定上清AST与ALT，收集上清进行液相色谱-高分辨质谱（Liquid Chromatography–High-Resolution Mass Spectrometry, LC–HRMS）非靶向代谢组学分析，用MS-DIAL进行峰检测对齐，MetaboAnalyst做统计分析筛选浓度依赖性变化的候选生物标志物，并以甘氨胆酸（Glycocholic Acid, GCA）标准品及候选对照品通过保留时间与碎片离子谱进行结构验证。

Results（结果）

细胞活力与常规肝损伤标志物评估

研究人员对两名供者PHH球状体进行浓度梯度唑类抗真菌药暴露，发现氟康唑（fluconazole, FCZ）无明显毒性，伏立康唑（voriconazole, VCZ）呈明显浓度依赖性毒性，其余多数唑类在高浓度下显示明显细胞毒性。同期检测上清AST与ALT，尽管有轻微升高趋势，但在各浓度组（含出现细胞毒性条件）均未检出显著差异，表明常规转氨酶在三维PHH模型中早期肝毒性阶段敏感性不足。

非靶向代谢组学筛选候选生物标志物

研究人员对给药后上清进行LC–HRMS非靶向代谢组学，归一化内标后关联细胞活力与代谢物变化，在两个供者中共同鉴定出正离子模式下m/z 180.1（保留时间5.9 min）及负离子模式下m/z 460.3（6.6 min）与m/z 464.3（7.0 min）三个特征峰，其强度随细胞活力下降呈现浓度依赖性改变。

生物标志物结构鉴定

负离子模式m/z 464.3033（保留时间7.0 min）与标准品GCA保留时间及特征碎片离子（m/z 74.0249、402.3040）匹配，确证为甘氨胆酸（GCA）；其在细胞毒性条件下上清分泌量显著降低。m/z 460.2737具类似GCA碎片特征（m/z 74.0249、398.2719），推测为GCA相关代谢衍生物。正离子模式m/z 180.1023（保留时间5.9 min），元素组成拟为C₁₀H₁₄NO₂，碎片离子m/z 91.0548（苄基）和62.0628（乙胺片段），与市售对照品（包括salsolinol等）不匹配，暂推断为1-amino-3-(benzyloxy)propan-2-one或其同分异构体，未最终确证。

Discussion（讨论与结论翻译）

DILI是临床严重ADR，唑类抗真菌药尤具DILI风险。三维PHH球状体较好保留肝特异性功能，适用于肝毒性评价。本研究用三维PHH球状体上清非靶向代谢组学，鉴定出GCA及m/z 180.1特征代谢物两个候选DILI生物标志物，二者与肝毒性程度密切相关且在相同样本中较AST、ALT更敏感——GCA随细胞活力下降而上清分泌减少。GCA属胆汁酸，已在多种肝病血浆中被报道异常，健康PHH球状体亦可分泌GCA，其浓度依赖性下调有望作为较敏感的体外肝毒性指示指标，动态监测胆汁酸谱或可助于临床早期发现DILI。m/z 180.1特征代谢物因不稳定等因素未完全确证，需进一步研究。综上，利用三维PHH球状体非靶向代谢组学发现的GCA及m/z 180.1特征物较传统AST/ALT更灵敏反映唑类抗真菌药早期肝毒性，具药物开发毒筛及临床DILI早期检测潜在价值；尚需扩大化合物及临床样本验证其灵敏度与特异性。本研究局限为仅分析上清 extracellular metabolites、未行胞内代谢组学，且受供者间PHH培养时长差异影响，未来可结合肝类器官等模型及建立标准化毒性评价平台进一步完善。