粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)双结构域糖基水解酶PgaB的生化与结构表征及其在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物膜降解中的应用

《ACS Infectious Diseases》：Biochemical and Structural Characterization of Two-domain Glycoside Hydrolase PgaB from Serratia marcescens and Its Application for S. aureus Biofilm Degradation

　　

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）是重大的全球健康威胁，据预测至2050年每年可导致多达1000万例死亡。细菌形成微生物生物膜（biofilm, BF）是其产生AMR的重要机制之一。因此，能够降解BF胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）的酶是潜在的BF破坏工具。本研究对来源于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的β-1,6-N-乙酰葡糖胺酶（β-1,6-N-acetylglucosaminidase，即SmPgaB）进行了表征，该双结构域酶共价连接糖基水解酶153家族（glycoside hydrolase family 153, GH153）模块和碳水化合物酯酶4家族（carbohydrate esterase family 4, CE4）模块。小角散射（small-angle X-ray scattering, SAXS）数据表明SmPgaB在溶液中以单体形式存在。研究人员证实SmPgaB可降解金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜，最高效率达92%，并抑制BF形成超过95%。此外，SmPgaB可增强庆大霉素（gentamicin）、四环素（tetracycline）和氯霉素（chloramphenicol）的杀菌效果，与这些抗生素联用时使浮游细胞（planktonic cells）存活率降低约50%。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）确认处理后BF发生显著的形态学改变。上述结果证明了β-1,6-N-乙酰葡糖胺酶作为BF相关感染辅助治疗药物的潜力，尤其是与常规抗生素联用时。

论文解读：粘质沙雷氏菌双结构域糖基水解酶PgaB的生化与结构表征及其在金黄色葡萄球菌生物膜降解中的应用

该研究发表于《ACS Infectious Diseases》。

研究背景与意义

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）是全球重大公共卫生问题，细菌生物膜（biofilm, BF）的形成是AMR的重要机制——BF的胞外基质主要由胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）、胞外DNA（eDNA）和蛋白质组成，可阻碍抗生素渗透、增强应激耐受及逃避免疫清除，使BF相关感染远比浮游菌感染难治愈。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是重要的革兰氏阳性BF形成病原菌，其BF关键骨架组分为部分脱N-乙酰化的聚-β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺（poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine, PNAG），又称胞间黏附多糖（polysaccharide intercellular adhesin, PIA），由icaADBC操纵子编码合成，广泛存在于多种病原菌中，是BF破坏策略的重要靶点。能修饰或降解PNAG的糖类活性酶（CAZymes）是极具前景的BF破坏工具，其中PgaB蛋白含N端CE4（carbohydrate esterase family 4）脱乙酰酶结构域和C端GH153（glycoside hydrolase family 153）水解结构域，可特异性改变PNAG乙酰化程度并水解其β-1,6-糖苷键，但此前仅大肠杆菌（Escherichia coli, EcPgaB）、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica, BbPgaB）和产气克雷伯菌（Klebsiella aerogenes, KaPgaB）的PgaB被研究，对PgaB结构多样性、底物特异性和PNAG依赖BF降解效率的认识存在显著空白，限制其作为抗BF制剂的转化开发。为此，研究人员以系统发育与已表征PgaB显著分化的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）PgaB（SmPgaB）为对象，进行克隆表达、生化与结构表征，并评估其对S. aureus PNAG富集BF的降解能力，以拓展对PgaB酶分子作用基础的理解并评价其作为PNAG靶向BF降解酶工具的潜力。

主要关键技术方法

研究人员从粘质沙雷氏菌基因组PCR扩增pgaB基因，克隆至pETTRXA-1a/LIC载体并在E. coli BL21(DE3)中诱导表达，经镍亲和及尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）纯化获得重组SmPgaB；以S. aureus 3株临床分离株（S. aureus 1/2/3）为对象完成全基因组测序组装与ica操纵子多态性分析；采用结晶紫法测定不同pH、温度及孵育时间下SmPgaB对成熟S. aureus BF的降解率及对新BF形成的抑制率，以Resazurin法检测与抗生素联用的活菌存活率，CLSM观察BF基质与死/活菌分布变化；通过ThermoFluor热位移实验测熔融温度（T_m）；用AlphaFold预测三维结构并与EcPgaB（PDB:4P7R）、BbPgaB（PDB:6AU1）比对，分子对接PNAG六糖至GH153及CE4结构域，ConSurf分析残基进化保守性；联用SEC与SAXS（SEC-SAXS）获取溶液态R_g、D_max及低分辨率分子包络，与AlphaFold模型比对验证溶液构象，辅以正常模式分析（normal mode analysis, NMA）和CABS-flex评估结构柔性。

研究结果

S. marcescens序列分析、克隆、表达与纯化

系统发育分析显示SmPgaB GH153和CE4序列归入最大簇且与气单胞菌、葡萄球菌、埃希氏菌等聚为一类。成功克隆表达后纯化得约50 mg/L，SDS-PAGE显示单一条带约72 kDa，与理论分子量73.292 kDa吻合，纯度合格。

SmPgaB的生化表征（Biochemical Characterization of SmPgaB）

以S. aureus 3 BF为底物测定，最适pH约5.0，在pH 4.0–7.0区间活性基本相当；20–40°C保持>95%最适活性，>60°C明显下降。40°C孵育3 h和24 h分别保留>90%和>80%活性，70°C 15 min失活60%，3 h完全失活，符合嗜温菌酶特征。

热位移实验分析结构稳定性（Analysis of Structural Stability Using Thermal Shift Assay）

48种缓冲液中最高T_m为70°C（pH 7.0磷酸钾缓冲液），pH 6.0–8.0无盐平均T_m≈55°C，加盐后同pH范围T_m降约3°C，单独加NaCl使平均T_m降1°C，表明高离子强度不利于SmPgaB结构稳定。

结构及结合位点分析（Structural and Binding Sites Analysis）

AlphaFold预测SmPgaB为双独立折叠结构域——N端CE4具7次α/β桶（(α/β)₇）并含典型His-Asp-Asp催化三联体（H52、D111、D112），C端GH153具(α/β)₈TIM桶折叠并形成长39.5 ?、宽15 ?的催化沟槽，可容纳PNAG延伸构象。PNAG六糖对接GH153域估算结合能ΔG = ?6.92 kcal/mol，结合沟槽内富含高度保守残基（ConSurf评分9–10），芳香残基W397/W549/W610/Y642参与π-堆叠，酸性残基D463（推测广义酸）、E471（推测广义碱）及H462参与催化/底物稳定，与EcPgaB D466、BbPgaB D474等价。CE4域PNAG片段对接显示底物结合于保守沟槽，D112和H181等价于EcPgaB D115/H184并可结合Co²⁺/Ni²⁺，CE4先脱除GlcNAc N-乙酰基生成部分脱乙酰PNAG供GH153下游水解。两域间连接肽约7个残基，短于BbPgaB，暗示较刚性域间关联；GH153活性中心比EcPgaB开放，类似BbPgaB，利于复杂修饰底物结合。

SEC-SAXS实验与结构分析（SEC-SAXS Experiments and Structural Analysis）

SAXS证实SmPgaB溶液中无聚集，Guinier区线性，R_g=28.56±0.07 ?，由P(r)函数得D_max=94.34 ?。SAXS-MoW估算分子量69.8 kDa（与理论偏差4.7%），SEC-MALS确认溶液为稳定单体（71.7 kDa）。归一化Kratky图呈类高斯峰（q·R_g≈1.73处达平台）但在高q·R_g未归零，提示域间存在一定柔性。ab initio DAMMIN重建包络呈双叶由窄连接区相连，与AlphaFold双域组织吻合且χ²=1.92；NMA与CABS-flex显示N端（18–100位）及C端波动较大（较高RMSD/RMSF），与EcPgaB结晶需切除两端无序区一致，推测两端无序区参与天然PgaABC复合物组装以增强脱乙酰酶（2.7倍）和水解酶（13倍）活性。

本研究用S. aureus分离株的基因组学研究（Genomic Studies of S. aureus Isolates Used in This Work）

三株S. aureus基因组~2.6 Mb、GC~32.7%、与参考基因组相似度>90%。共线性分析显示S. aureus 1与2基因顺序严格保守，S. aureus 3存在~0.3–0.4 Mb倒位但不涉及ica操纵子（S. aureus 3中icaADBC位于32046–36184位）。ica启动子区高度保守仅S. aureus 3在?144位有点突变；S. aureus 3含截短无功能icaR（ica操纵子转录抑制因子）→ica操纵子去抑制→大量PNAG合成。IcaA 100%相同，IcaB/C/D存在≤4个非同义替换。

生物膜根除与抑制分析（Biofilm Eradication and Inhibition Analysis）

SmPgaB（50 μg/mL，4 h）对S. aureus 1/2/3成熟BF降解率分别为40%、30%、92%（S. aureus 3因PNAG丰富最敏感）；KaPgaB对照验证S. aureus 3 BF更易被PNAG靶向酶降解，DNase对S. aureus 1/2有效但对S. aureus 3几乎无效（PNAG-EPS保护eDNA），木瓜蛋白酶均可显著降解三者BF。CLSM显示S. aureus 3 BF经SmPgaB处理后Calcofluor White（多糖）信号大幅减弱，SYPRO Ruby（蛋白）信号同步下降（基质多糖-蛋白互连）。BF形成抑制实验中，50 μg/mL SmPgaB使S. aureus 3 BF形成抑制95%，S. aureus 1/2分别为36%、27%，与PNAG含量差异相符。

SmPgaB生物膜降解引起的抗生素敏感性变化（Changes in Sensitivity to Antibiotics Caused by SmPgaB Biofilm Degradation）

S. aureus 3为庆大霉素（≥16 μg/mL）、四环素（≥16 μg/mL）、氯霉素（≥32 μg/mL）耐药株。单独抗生素（50或500 μg/mL）对BF内活菌影响有限，联用50 μg/mL SmPgaB后活菌分别额外降低：庆大霉素49%（50 μg/mL）/55%（500 μg/mL）、四环素46%/52%、氯霉素36%/41%；抗生素浓度提高10倍未显著增效，表明酶介导BF破坏是主要增敏因素。CLSM Live/Dead染色显示单用抗生素仅影响BF表层，联用SmPgaB后在PNAG被降解区域死菌信号明显增强。

讨论与结论总结

研究人员在此首次报道了粘质沙雷氏菌SmPgaB的完整生化与结构表征。结果确认SmPgaB具CE4脱乙酰酶结构域与GH153 β-1,6-N-乙酰葡糖胺水解结构域的双域架构；该酶对富含PNAG的S. aureus BF具高达92%的降解效率及>95%的BF形成抑制能力；与庆大霉素、四环素、氯霉素联用可显著增强抗生素对耐药BF内活菌的杀灭效果（浮游细胞活力降低约36%–55%），CLSM证实BF形态显著改变。结果表明SmPgaB β-1,6-N-乙酰葡糖胺酶可用于水解降解PNAG富集的S. aureus BF，并通过此方式提升常规抗生素穿透性与杀菌效率，具备作为PNAG靶向抗BF酶制剂的应用潜力。