Pristimerin(雷公藤红素同类化合物)通过抑制Janus激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)致癌信号通路诱导线粒体及Caspase依赖性细胞凋亡发挥抗多发性骨髓瘤作用

《ACS Pharmacology & Translational Science》：Pristimerin Suppresses Janus Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription Oncogenic Signaling To Drive Mitochondrial and Caspase-Dependent Apoptosis in Multiple Myeloma

　　

摘要：多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是一种浆细胞恶性肿瘤，特征为骨髓内克隆性浆细胞失控性增殖，尽管治疗取得重大进展，仍基本无法治愈。因此，发现能够克服凋亡抵抗并靶向关键生存通路的新药至关重要。本研究在体外探讨了天然醌甲基三萜类化合物雷公藤红素同类化合物Pristimerin(Prist)对MM的抗癌潜力。Prist呈剂量依赖性地显著抑制U266和RPMI8226细胞活力，并诱导SubG0/G1期细胞周期阻滞，提示凋亡性细胞死亡。机制研究表明Prist通过Caspase级联激活触发凋亡，并靶向MM关键致癌驱动因子——JAK/STAT信号通路。网络药理学与分子对接提示Prist可与STAT3活性位点(STAT3是JAK/STAT通路关键组份)结合，支持其抑制作用。Western blot分析显示Prist降低MM细胞中组成型磷酸化STAT3(p-STAT3)及白细胞介素6(IL-6)刺激上调的p-STAT3水平，进一步验证STAT3通路失活。重要的是，Prist与硼替佐米(Bortezomib, BTZ)联用具有协同增效作用，可进一步增强Caspase活化与凋亡信号。综上，这些发现表明Prist是一种强效天然化合物，通过诱导凋亡并阻断STAT3驱动的致癌信号抑制MM进展，突显其作为MM单独或联合用药策略的治疗前景，值得进一步评估。

论文解读：Pristimerin抑制JAK/STAT致癌信号诱导线粒体及Caspase依赖性凋亡抗多发性骨髓瘤的研究

一、研究背景与意义

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是克隆性浆细胞恶性肿瘤，以骨髓中异常B淋巴细胞来源浆细胞扩增、单克隆免疫球蛋白过度产生及进行性终末器官损害为特征。尽管免疫调节药物(Immunomodulatory Drugs, IMiDs)、蛋白酶体抑制剂(Proteasome Inhibitor, PI, 如Bortezomib, BTZ)、单克隆抗体及自体造血干细胞移植改善了患者预后，MM仍基本无法治愈，多数患者因耐药克隆持续存在及肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)支持而复发，5年生存率仅约40%—49%。MM生物学的关键特征是多种致癌通路激活促进生存、增殖、免疫逃逸及凋亡抵抗，其中Janus激酶/信号转导与转录激活因子3(Janus Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription 3, JAK/STAT3)通路尤为重要——大多数MM中存在STAT3持续活化，由内部突变及骨髓微环境产生的白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)等细胞因子驱动，组成型活化STAT3调控Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Survivin及Cyclin D1等抗凋亡与促生存基因表达，介导MM进展及治疗抵抗。因此靶向STAT3信号是克服MM凋亡抵抗、增强临床反应的有前景策略。天然产物因其结构多样性、多靶点机制及相对低毒性受关注，Pristimerin(Prist)是从卫矛科(Celastraceae)及翅子藤科(Hippocrateaceae)植物中提取的天然醌甲基三萜类(Quinone Methide Triterpenoid)化合物，既往报道在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及血液系统恶性肿瘤中具有抑制肿瘤生长、抗转移、抗血管生成及促凋亡/自噬作用，可影响核因子κB(Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)、蛋白酶体活性、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)等通路。鉴于STAT3在MM发病中的核心地位及Prist已知抗癌活性，研究人员探究Prist能否有效靶向MM生存通路。本研究系统评估Prist对MM细胞系的抗增殖与促凋亡效应，通过网络药理学、分子对接及生化实验明确其靶向STAT3并抑制JAK/STAT致癌信号、诱导活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)依赖性线粒体凋亡，且与BTZ具协同作用。论文发表于ACS Pharmacology & Translational Science。

二、主要关键技术方法

研究人员采用人MM细胞系U266、RPMI8226、MM.1S及EB病毒(Epstein–Barr Virus, EBV)转化健康供者B淋巴母细胞样细胞系(B-Lymphoblastoid Cell Lines, B-LCLs)；通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞活力并计算半数抑制浓度(IC₅₀)，活/死细胞染色(Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit)观察细胞死亡，膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/Propidium Iodide, PI)双染流式细胞术定量凋亡，碘化丙啶染色分析细胞周期亚G0/G1(SubG0/G1)期分布；通过网络药理学(SwissTargetPrediction、Super-PRED、Way2Drug预测靶点 intersect GeneCards中MM相关基因)构建蛋白互作(Protein–Protein Interaction, PPI)网络(CytoHubba筛选枢纽基因)，对STAT3(PDB ID: 6TLC)进行诱导拟合分子对接(AutoDockFR)；Western blot检测磷酸化STAT3(p-STAT3^Tyr705)、总STAT3、磷酸化AKT(p-AKT^Ser473)、总AKT、Caspase-8、-9、-3及剪切型Cleave Caspase-3、聚ADP核糖聚合酶(Cleaved Poly ADP-ribose Polymerase, Cleaved PARP)、Bcl-2家族(Bax、Bcl-2)、细胞周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin B1)、周期蛋白依赖性激酶(CDK4、CDK6)、γH2AX(p-H2AX, DNA双链断裂标志)、X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein, XIAP)、细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)等；JC-1探针流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP, ΔΨm)丧失，CellROX与MitoSOX Red分别检测胞内与线粒体内超氧化物水平评估ROS；N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)清除ROS验证ROS上游作用；Chou–Talalay法(CalcuSyn软件)计算联合指数(Combination Index, CI)评估Prist与BTZ协同性。

三、研究结果

Prist Suppresses Cell Viability and Induces Apoptosis in MM Cells（Prist抑制MM细胞活力并诱导凋亡）

Prist(0—4 μM, 24 h)处理U266、RPMI8226、MM.1S细胞呈剂量依赖性抑制活力，U266与RPMI8226的IC₅₀分别为0.162 μM与0.310 μM；Live/Dead染色见剂量依赖性死细胞(EthD-1阳性)增加。细胞周期分析显示SubG0/G1期细胞比例剂量依赖性升高，提示凋亡性DNA片段化，伴随Cyclin D1、Cyclin B1、CDK4、CDK6下调。Annexin V/PI双染见剂量依赖性早期+晚期凋亡率升高，p-H2AX(γH2AX^Ser139)上调提示DNA双链断裂。Western blot示Caspase-9、-3活化(剪切为Cleaved Caspase-3)及PARP剪切，流式中Cleaved PARP阳性细胞增多。结论：Prist通过激活Caspase依赖性凋亡通路抑制MM细胞活力。

Prist Activates Both Intrinsic and Extrinsic Mitochondrial Apoptotic Pathways in MM Cells（Prist激活MM细胞内外源性线粒体凋亡通路）

Prist处理上调Cleaved Caspase-8及截断型Bid(tBid)，连接死亡受体信号与线粒体损伤；上调促凋亡Bax、下调抗凋亡Bcl-2，JC-1染色示线粒体膜电位(MMP)剂量依赖性丧失(红/绿荧光比下降)。结论：Prist通过外源性Caspase-8/Bid活化及内源性Bax/Bcl-2失衡致线粒体去极化，协同启动线粒体凋亡。

Target Identification of Prist in MM Cells through a Network Pharmacology Approach and Molecular Docking with STAT3（网络药理学靶标识别及与STAT3分子对接）

整合三个数据库预测Prist靶点，与GeneCards中MM高相关性基因取交集得127个重叠靶标，STRING构建PPI网络经CytoHubba按度值筛选出前十枢纽基因为STAT3、AKT1、EGFR、MTOR、MMP9、MAPK1、PARP1、KDR、PRKACA、AR，其中STAT3评分最高选作核心靶。分子对接显示Prist与STAT3 SH2结构域结合能?5.632 kcal/mol，与Lys591、Ser636等关键残基形成相互作用。结论：网络药理学与对接提示Prist可直接结合STAT3活性位点，抑制其功能是潜在核心机制。

Prist Suppresses Constitutive and IL-6-Driven STAT3 Activation in MM Cells（Prist抑制MM细胞中组成型及IL-6诱导的STAT3活化）

Prist剂量依赖性降低U266与RPMI8226细胞p-STAT3^Tyr705水平但不改变总STAT3蛋白量；同时抑制p-AKT^Ser473及下游抗凋亡蛋白cIAP1、XIAP、Bcl-xL。预处理Prist可阻断外源IL-6(100 ng/mL)诱导的STAT3磷酸化。结论：Prist选择性抑制组成型及骨髓微环境IL-6驱动的STAT3活化，并协同抑制AKT/抗凋亡蛋白生存通路。

Prist-Induced Apoptosis Is Critically Dependent on Reactive Oxygen Species (ROS) Generation in MM Cells（Prist诱导凋亡关键依赖于MM细胞内ROS生成）

Prist处理使CellROX与MitoSOX Red荧光强度剂量依赖性升高(胞内及线粒体内超氧化物增加)；NAC预处理完全逆转Prist所致细胞形态损伤、活力恢复、p-H2AX减少，并抑制Caspase-3、-8活化及PARP剪切，Annexin V/PI凋亡率回降。结论：ROS蓄积是Prist触发线粒体损伤与Caspase级联活化上游必需事件。

Prist Synergizes with Bortezomib to Potentiate Antitumor Activity in U266 Cells（Prist与硼替佐米联用协同增强U266细胞抗肿瘤活性）

低毒浓度Prist(0.25 μM)联合BTZ(5 nM)处理U266细胞，Chou–Talalay法计算得联合指数CI=0.48066(<1为协同)，剂量降低指数(Dose-Reduction Index, DRI)显示两药均可大幅减量达同等效应。联合组较单药更显著致细胞变圆、脱壁、死细胞增多，CCK-8活力更低；Western blot示p-STAT3进一步降低、Bid减少，Cleaved Caspase-8、-3及Cleaved PARP更强上调。结论：Prist与BTZ具强协同抗MM效应，通过抑制STAT3生存信号放大凋亡级联，可降低BTZ临床用量并可能克服耐药。

Prist Increases BTZ Sensitivity and Augments Apoptotic Signaling（Prist提高BTZ敏感性并增强凋亡信号）

形态学及Live/Dead染色证实联合处理较单药细胞死亡更多；Western blot显示联用较单药更显著降低p-STAT3与Bid，Cleaved Caspase-8、-3及Cleaved PARP增幅更大。结论：Prist通过抑制STAT3并放大Caspase依赖性凋亡使MM细胞对BTZ再增敏。

Prist Exhibits Potent Antiproliferative and Proapoptotic Effects in EBV-Transformed B Lymphoblastoid Cell Lines (B-LCLs)（Prist对EBV转化B淋巴母细胞样细胞系具强抗增殖与促凋亡效应）

Prist剂量依赖性抑制B-LCLs活力，致细胞皱缩、脱落，Live/Dead染色死细胞增加；Annexin V/PI示凋亡率剂量升高，Western blot见Cleaved Caspase-3与Cleaved PARP上调，且p-STAT3^Tyr705降低而总STAT3不变。结论：Prist可拮抗EBV-LMP1驱动的JAK/STAT生存信号并诱导凋亡，其STAT3抑制—Caspase凋亡轴在EBV相关B细胞恶变背景下同样成立。

四、讨论总结与结论翻译

研究人员讨论指出MM凋亡抵抗主要由JAK/STAT3轴驱动，Prist通过ROS生成—线粒体去极化—Caspase活化及STAT3磷酸化抑制双重机制杀灭MM细胞；网络药理学与对接锁定STAT3为枢纽靶，实验验证Prist抑制组成型及IL-6诱导p-STAT3并下调其转录靶基因(cIAP1、XIAP、Bcl-xL)；ROS为上游启动因素(NAC可挽救)；与BTZ协同(CI<1)并通过抑制STAT3增敏BTZ、放大凋亡，具备克服BTZ耐药潜力；B-LCLs实验佐证Prist可抑制EBV驱动的组成型STAT3活化。研究局限性含仅用细胞系及B-LCLs未模拟骨髓微环境复杂性、NAC非特异性、STAT3直接结合需细胞水平验证(CETSA/Pull-down等)、需患者原代细胞及体内PK/PD/毒性评价、Prist水溶性差需纳米制剂改良。

结论(原文翻译)：

本研究表明Prist通过产生活性氧(ROS)、破坏线粒体完整性、激活Caspase及直接抑制STAT3信号发挥强效抗MM作用。Prist可扰乱肿瘤生存通路、提高MM细胞对硼替佐米的敏感性并减弱微环境IL-6驱动信号，其对EBV转化B-LCLs的有效性进一步拓宽其治疗潜能。网络药理学与分子对接确认Prist可结合STAT3 SH2结构域支持其抑制作用。结果强烈支持进一步研究Prist单独或联合方案用于克服耐药及改善MM疗效。