基于多光子活性红光发射BODIPY染料的成纤维细胞脂滴对葡萄糖响应研究

《Chemical & Biomedical Imaging》：Lipid Droplet Response to Glucose in Fibroblast Cells Using Multiphoton-Active Red-Emitting BODIPYs

　　

研究人员合成了两种带有3,5-噻吩乙烯基单元的BODIPY（硼-二吡咯甲烯）染料，通过光谱学和活细胞实验研究了噻吩2位与3位连接方式的影响。2位连接可实现向BODIPY核心更有效的电子供给，产生红移发射；而3位连接则引起BODIPY核心的轻微扭曲，降低摩尔消光系数并减弱共轭参与程度。这些染料可通过单光子红光或双光子近红外光有效激发，具有良好的光物理特性，适用于活细胞显微成像。低能量激发具有重要意义，因为红光具有较低的细胞毒性和更深的组织穿透能力。研究人员报道的两种化合物明亮且光稳定，双光子吸收截面（σ²）分别达397 GM（1 GM = 10^–50 cm⁴ s photon^–1）@950 nm和279 GM @820 nm。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）单光子和多光子激发实验均显示脂滴（LD）积累现象，两种染料的最佳给药方案均为500 nM孵育30分钟。油酸（一种已知可诱导脂滴增殖的脂肪酸）孵育实验确认了这些染料可用于定量分析。此外，两种染料在脂滴中至少保留24小时且毒性极小。研究人员利用这些特性研究了细胞对外源性葡萄糖的脂滴响应；当葡萄糖浓度从17.5 mM增加至30 mM时，观察到脂滴数量显著增加（均值从13.6个增至68.5个脂滴/细胞）。研究脂滴对葡萄糖的响应对于深入理解癌症、阿尔茨海默病和糖尿病等疾病至关重要，而本研究所呈现的荧光染料可能成为实现这一目标的关键工具。

研究背景方面，葡萄糖作为人类细胞呼吸的主要底物，其过量与肥胖、糖尿病、癌症以及阿尔茨海默病（AD）等多种疾病密切相关。高浓度胞外葡萄糖可通过甘油三酯生物合成促进脂质积累，并与活性氧（ROS）生成相关。脂滴作为动态细胞器，参与疏水性分子的细胞内生成、储存和运输，其异常与糖尿病、癌症和肥胖等疾病相关。因此，理解胞外葡萄糖浓度与典型细胞系如成纤维细胞脂滴响应之间的关系，对于理解多种疾病具有重要意义。荧光显微镜是细胞成像的基础工具，而BODIPY染料自1968年首次分离以来已成为该领域重要的荧光探针。然而，目前商业化的活细胞兼容荧光脂滴染剂，尤其是具有红/近红外发射和强多光子活性的染剂仍然有限。常用染剂如BODIPY 493/503和尼罗红存在非特异性染色其他亲脂性细胞器、光稳定性有限等问题，因此亟需开发新型低毒性、长波长激发的染剂。

研究人员开展了以下研究：合成并表征了两种新型脂滴靶向BODIPY染料BDP-1和BDP-2，系统研究了噻吩连接位置对光物理性质的影响；评估了染料的多光子活性；在鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）中验证了脂滴靶向能力和成像适用性；建立了油酸诱导的脂滴增殖定量模型；最终研究了成纤维细胞对胞外葡萄糖浓度变化的脂滴响应机制。

研究结论表明，BDP-1和BDP-2是含有3,5-位乙烯噻吩基团的小分子有机荧光染料。改变噻吩连接位点仅一个碳原子即对光谱学性质产生显著影响，但对其细胞内行为（包括摄取、定位、稳定性和保留性）无明显影响。两种染料均能在低浓度短时间孵育后特异性定位于细胞内脂滴。红色单光子或近红外双光子激发、低细胞毒性以及持续保留于脂滴中的特性，使这些染料适用于长时间活细胞激光扫描共聚焦显微成像。通过油酸诱导脂滴增殖的成熟实验方案，确认了BDP-1和BDP-2可作为细胞内脂滴数量的可靠定量评估工具，该特性被用于建立成纤维细胞的葡萄糖介导脂滴响应模型。当培养基葡萄糖浓度从17.5 mM升至30 mM时，脂滴数量出现显著增加，该研究为理解哺乳动物细胞对胞外葡萄糖的敏感性、健康细胞对该刺激的反应能力提供了新见解，并确认BDP-1和BDP-2是长时间定量脂滴研究及诊断应用的有力候选染料。该论文发表在《Chemical》。

关键技术方法包括：采用Knoevenagel缩合反应合成目标染料，通过紫外-可见光谱监测反应进程，反相高压液相色谱（HPLC）纯化产物；利用稳态光谱、时间相关单光子计数（TCSPC）进行光物理表征；通过X射线晶体学和密度泛函理论（DFT）及含时密度泛函理论（TD-DFT）计算分析分子结构与电子性质；采用双光子诱导荧光测量法测定双光子吸收截面（σ²）；以鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）为模型，运用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行单光子和多光子活细胞成像，通过Pearson相关系数分析共定位，并以BioTracker 488 Green Lipid Droplet Dye作为脂滴定位验证标准。

研究结果按章节介绍如下：

合成程序：以2,4-二甲基吡咯与4-氯苯甲醛经三氟乙酸（TFA）催化的缩合反应为起始，经2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌（DDQ）氧化和硼螯合得到BODIPY核心结构，三步总收率57%。随后通过严格控制温度（70 °C最优）的Knoevenagel缩合反应引入乙烯噻吩基团，分子筛除水促进反应完全。

表征：两种染料在二氯甲烷中的光物理参数显示，BDP-1（λ_abs = 653 nm，λ_em = 668 nm，ε = 123,000 M^–1 cm^–1，Φ = 42%，τ = 3.2 ns）和BDP-2（λ_abs = 629 nm，λ_em = 641 nm，ε = 92,000 M^–1 cm^–1，Φ = 79%，τ = 4.5 ns）。BDP-1因2位连接更强的电子供给而红移，但BDP-2具有更高的光致发光量子产率（PLQYs）和整体亮度（72,700 vs 51,700 M^–1 cm^–1）。1,7-位甲基有效限制了meso-芳基环的旋转，使染料对粘度不敏感。X射线晶体结构揭示BDP-1具有C₂对称轴，而BDP-2呈非对称结构，噻吩取向相反。TD-DFT计算证实2位连接时噻吩单元对HOMO和LUMO轨道的贡献更大，BDP-1的HOMO-LUMO能隙（1.91 eV）小于BDP-2（2.07 eV）。

多光子活性：幂律分析证实两种染料均经历双光子激发（2PE）过程，发射光谱与单光子激发一致。BDP-1在950 nm处σ²达397 GM，BDP-2在820 nm处为279 GM，前者创同类脂滴染料最高值。

基础与多光子显微镜：500 nM、30分钟孵育条件下，两种染料均特异性定位于脂滴，与BioTracker 488的Pearson相关系数分别为0.86（BDP-1）和0.87（BDP-2）。多光子成像时浓度增至2 μM以补偿2PE效率的固有限制。染料在脂滴中保留达24小时，5 μM浓度下24小时细胞毒性可忽略，光稳定性半衰期分别为8.63 h（BDP-1）和6.57 h（BDP-2）。

油酸诱导脂滴增殖监测：0.5 μM油酸过夜孵育使细胞脂滴均值从16.8个增至137.0个（P ≤ 0.0001），证明了染料的定量评估能力。

成纤维细胞脂滴对葡萄糖的响应：培养基葡萄糖浓度从17.5 mM增至20 mM时，脂滴均值从13.6增至24.8（P ≤ 0.01）；增至30 mM时达68.5个（P ≤ 0.0001）；30 mM与50 mM间无显著变化，提示已达最大响应。机制上，过量葡萄糖促进糖酵解，增加丙酮酸和甘油-3-磷酸（G3P）产生；G3P可转化为磷脂、二酰甘油和甘油三酯（TG），而丙酮酸经三羧酸（TCA）循环产生柠檬酸，进而生成乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。丙二酰辅酶A作为肉碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1）的别构抑制剂，抑制脂肪酸（FA）线粒体转运，导致胞质FA和长链酰基辅酶A酯积累并转化为TG，最终促进脂滴增殖。

讨论与结论部分总结：尽管葡萄糖的整体响应程度低于油酸，但研究明确显示了葡萄糖浓度增加对脂滴数量的显著影响，突出了使用BDP-1和BDP-2等小分子有机染料作为糖尿病、肥胖或癌症等疾病潜在诊断工具的重要性。改变噻吩连接位点对光谱学性质有显著影响，但对细胞内行为无显著影响，两种染料均为有竞争力的长时间定量脂滴研究候选染料。