《Frontiers in Immunology》：Screening and validating HBV mother-to-child transmission-related lncRNAs based on the lncRNA-mRNA co-expression network
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背景：尽管采用标准免疫预防方案，即乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）和乙型肝炎疫苗联合免疫，仍有部分乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性母亲所产婴儿发生乙型肝炎病毒（HBV）母婴传播（MTCT）。免疫预防失败的分子机制尚未完全阐明。长链非编码RNA（Long non
背景：尽管采用标准免疫预防方案，即乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）和乙型肝炎疫苗联合免疫，仍有部分乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性母亲所产婴儿发生乙型肝炎病毒（HBV）母婴传播（MTCT）。免疫预防失败的分子机制尚未完全阐明。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs, lncRNAs）作为抗病毒免疫反应的重要调控因子日益受到关注，但其在HBV母婴传播中的作用尚未充分揭示。方法：研究人员采集免疫预防成功和失败的HBsAg阳性母亲所产婴儿外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），同时采集健康婴儿样本作为对照。采用全转录组RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）鉴定差异表达mRNAs和lncRNAs。通过基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析探讨相关生物学功能和信号通路。构建lncRNA-mRNA共表达网络以识别潜在调控关系。进一步采用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR, RT-qPCR）对关键基因进行验证。结果：免疫预防失败组与成功组之间共鉴定出2,647个差异表达mRNAs和1,082个差异表达lncRNAs。功能富集分析显示，这些基因主要参与免疫相关生物学过程，包括细胞因子介导的信号传导、中性粒细胞活化和先天免疫应答。KEGG通路分析显示其在乙型肝炎、MAPK信号通路和NOD样受体信号通路中显著富集。lncRNA-mRNA共表达网络鉴定出440个与母婴传播阻断失败相关的潜在调控相互作用。RT-qPCR验证结果显示，与免疫预防成功组相比，HRAS在免疫预防失败组中显著下调，而ICAM1、NAMPT和SOD2显著上调。结论：研究揭示了HBV母婴传播相关的独特转录组特征，提示免疫相关基因和lncRNA-mRNA调控网络的失调可能与母婴传播预防失败相关。特别是，HRAS、ICAM1、NAMPT和SOD2的表达改变可能代表与HBV母婴传播相关的候选生物标志物，涉及病毒传播和婴儿免疫应答。这些发现为HBV母婴传播的分子特征提供了初步认识，可能有助于指导未来的机制研究和临床研究。
本研究发表于《Frontiers in Immunology》，旨在探讨乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）母婴传播（Mother-to-child transmission, MTCT）中免疫预防失败的分子机制，特别关注长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）及其与mRNA的共表达网络在其中的作用。
研究背景与问题：乙型肝炎是由HBV感染引起的传染性疾病，主要经血液暴露和性接触传播。尽管标准免疫预防策略包括乙型肝炎免疫球蛋白（Hepatitis B immunoglobulin, HBIG）和乙型肝炎疫苗已显著降低垂直传播风险，但仍无法完全消除母婴传播，预防失败依然存在。新生儿期感染者超过90%发展为慢性感染，超过50%的新发乙型肝炎病例归因于宫内感染和母婴传播，垂直传播已成为新发HBV感染和慢性病例的主要来源。既往研究多聚焦于母体病毒学和临床因素，如HBV DNA载量、乙型肝炎e抗原（Hepatitis B e antigen, HBeAg）状态及妊娠期抗病毒治疗，而对婴儿免疫应答和转录调控在母婴传播中的作用关注相对不足。非编码RNA，尤其是微小RNA（microRNA, miRNA）已证实参与HBV复制、免疫逃逸和宿主抗病毒应答，但lncRNA在HBV母婴传播中的研究相对匮乏。与miRNA相比，lncRNA具有更复杂的调控功能，可通过表观遗传修饰、转录调控、染色质重塑及竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA, ceRNA）机制同时影响多个下游免疫相关通路。因此，探索lncRNA相关的转录调控网络对于理解HBV母婴传播的免疫学机制、识别早期敏感生物标志物、改进预防控制策略具有重要意义。
研究方法与技术路线：研究人员从广西柳州市各级医院和妇幼保健机构2023年7月至2024年1月的"桂妇儿健康服务信息管理系统"中，筛选HBsAg阳性孕妇所产婴儿建立队列，同时纳入HBsAg阴性母亲所产健康婴儿作为对照。样本来源为：预防失败组6例、预防成功组10例、健康对照组6例，共计22例婴儿的外周血单个核细胞（PBMCs）用于全转录组测序。该技术路线主要包括：第一，全转录组RNA测序及生物信息学分析，使用Illumina HiSeq/NovaSeq平台进行150 bp双端测序，STAR软件比对至人类基因组GRCh38，采用DESeq2进行差异表达基因分析，筛选标准为错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正后p值小于0.05且log2倍数变化绝对值大于1；第二，GO和KEGG功能富集分析，使用R语言clusterProfiler包推断潜在分子机制；第三，lncRNA-mRNA共表达网络构建，采用R语言cor.test函数进行相关性检验，以FDR校正后p值小于0.05为筛选标准，使用Cytoscape 3.7.1可视化网络；第四，蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction, PPI）网络分析，使用STRING数据库及Cytoscape的MCODE和cytoHubba插件鉴定枢纽基因；第五，RT-qPCR验证，以GAPDH为内参，采用SYBR? Premix Ex Taq? II荧光染料法在Roche LightCycler 480II仪器上检测，通过2
-ΔCp法计算相对定量，在10个候选基因中验证出4个关键基因。
研究结果：
差异基因表达分析：与预防成功组相比，预防失败组鉴定出2,647个差异表达mRNAs，其中1,793个上调、854个下调；同时鉴定出1,082个差异表达lncRNAs，其中755个上调、327个下调。与健康对照组相比，预防失败组鉴定出151个差异表达mRNAs和75个差异表达lncRNAs。两组比较共识别出28个共同上调mRNA和31个共同上调lncRNA，包括NEAT1和BASP1-AS1等。
GO和KEGG富集分析：差异表达mRNAs主要富集于免疫相关生物学过程，包括中性粒细胞活化、先天免疫调节、抗病毒应答和囊泡介导的转运；lncRNAs主要富集于转录调控、凋亡信号、自噬、黏着斑和免疫相关通路。KEGG分析显示，差异表达mRNAs主要富集于NOD样受体信号通路、乙型肝炎通路、自噬和内吞作用；lncRNA靶基因富集于NOD样受体、MAPK、PI3K-Akt和肝炎相关通路。
lncRNA-mRNA共表达网络分析：预防失败组与成功组之间鉴定出440个lncRNA-mRNA共表达基因对，预防失败组与健康对照组之间鉴定出72个共表达基因对。其中ENSG00000228201、ENSG00000262528各调控11个mRNA，ENSG00000282907调控7个mRNA。对共表达网络的GO和KEGG分析进一步确认其在免疫调节、炎症反应、转录调控和HBV相关信号通路中的富集。
PPI网络与枢纽基因筛选：预防失败组与成功组比较中，JUN在PPI网络中处于中心位置，枢纽基因包括JUN、KMT2C、KRAS、HRAS、STK11、E2F3和BCL6，主要关联转录调控、抗病毒免疫应答、细胞内信号通路和细胞增殖；预防失败组与健康对照组比较中，ICAM1处于中心位置，枢纽基因包括ICAM1、NAMPT、FOS、PFKFB3、BCL6、SPI1和CEBPB，主要涉及炎症激活、细胞因子介导的信号传导、免疫细胞分化和免疫代谢调控。
RT-qPCR验证结果：与预防成功组相比，预防失败组中HRAS显著下调；与健康对照组相比，ICAM1、NAMPT和SOD2显著上调。这一结果提示HRAS下调可能与HBV母婴传播预防失败相关，而ICAM1、NAMPT和SOD2的上调则可能反映免疫激活、免疫代谢改变和氧化应激反应。
讨论总结：研究人员指出，即使采用标准被动-主动免疫预防，仍有少数婴儿发生突破性感染，提示宿主免疫失调和病毒免疫逃逸机制可能参与预防失败。本研究通过PBMCs转录组分析提供的仅为探索性证据而非直接因果关系证明。研究结果显示，预防失败组存在广泛的免疫相关基因表达模式改变，涉及抗病毒免疫、细胞因子介导的信号传导、T细胞活化、先天免疫调节、炎症反应和吞噬体相关通路，表明母婴传播阻断失败可能与免疫应答失调而非孤立基因异常相关。lncRNA测序结果进一步支持免疫失调在其中的作用，差异表达lncRNAs富集于转录调控、细胞因子信号、凋亡、自噬和免疫相关生物过程。值得注意的是，mRNAs和lncRNAs在乙型肝炎通路中均显著富集，涉及JUN、MAP2K6、KRAS、IFNAR1、E2F3、MAPK12、YWHAB和HRAS等基因，其中JUN在PPI网络中处于中心位置，提示其参与免疫和炎症信号调控。IFNAR1作为I型干扰素信号的关键受体，其信号受损可能削弱抗病毒免疫应答并促进病毒持续存在。RT-qPCR验证的HRAS、ICAM1、NAMPT和SOD2具有潜在转化价值：HRAS下调可能与传播失败相关；ICAM1升高反映炎症激活和免疫细胞 trafficking 改变；NAMPT作为NAD salvage通路的限速酶，其增加可能反映与抗病毒控制失效相关的免疫代谢改变；SOD2升高可能代表对病毒暴露和免疫激活诱导的氧化应激的代偿性反应。研究局限性包括样本量较小，尤其预防失败组仅6例，统计效力有限，需谨慎解读；未来需要多中心大样本研究验证，并结合胎盘组织、母体PBMCs、脐带血及功能免疫实验阐明机制。
结论：本研究通过转录组测序表征了HBV母婴传播免疫预防失败婴儿、预防成功婴儿和健康对照婴儿之间mRNAs和lncRNAs的差异表达谱。RT-qPCR验证进一步证明HRAS下调可能与HBV母婴传播预防失败相关，而NAMPT、ICAM1和SOD2上调可能与HBV母婴传播相关。GO和KEGG富集分析表明差异表达基因主要参与免疫相关通路，包括细胞因子介导的信号传导、先天免疫应答、中性粒细胞和T细胞参与的免疫过程，以及NOD样受体信号通路和乙型肝炎通路。总体而言，该研究为失调的lncRNA-mRNA转录网络可能与HBV母婴传播相关提供了初步证据，为理解HBV母婴传播的分子机制提供了新见解，可能为改进HBV垂直传播预防策略提供潜在生物标志物和靶点，但尚需更大样本量的研究和功能实验加以验证。
