《Frontiers in Immunology》：Transcriptomic profiling and IgM and IgT repertoire dynamics in rainbow trout gills following primary and secondary challenge with Lactococcus petauri
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摘要：鱼类黏膜组织缺乏哺乳动物中特有的有序淋巴组织结构。尽管鰓亦如此，其鳃相关淋巴组织（gill-associated lymphoid tissue, GIALT）主要由散布于上皮和鳃小片中的B细胞和T细胞组成，但在部分种类如虹鳟（Oncorhynchus
摘要：鱼类黏膜组织缺乏哺乳动物中特有的有序淋巴组织结构。尽管鰓亦如此，其鳃相关淋巴组织（gill-associated lymphoid tissue, GIALT）主要由散布于上皮和鳃小片中的B细胞和T细胞组成，但在部分种类如虹鳟（Oncorhynchus mykiss）或大麻哈鱼（Salmo salar）中亦可识别一种较有序的结构——鳃间淋巴组织（interbranchial lymphoid tissue, ILT）。虽然诸多研究已探讨鳃对刺激或病原体入侵的免疫应答，揭示了固有免疫与适应性免疫组分的激活，但鳃如何应对二次刺激或局部是否协调记忆应答仍属未知。为探究此问题，研究人员采用格氏乳球菌（Lactococcus petauri）对虹鳟进行浸浴初次感染，并对存活鱼进行再次感染或模拟感染对照，未感染对照组亦设平行处理。末次感染后第4天剖杀鱼只，取鳃组织进行RNA测序（RNA sequencing, RNAseq）转录组分析及IgM与IgT受体库（repertoire）分析，并以酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot）检测鳃中分泌总IgM及特异性IgM的细胞数。研究结果表明，虹鳟鳃中存在局部协调的记忆应答——再次感染组鱼未上调炎症相关基因（与初次感染不同），而优先改变与适应性免疫尤其是B细胞功能相关的基因，并发生显著的IgM与IgT克隆扩增（clonal expansion）；相应之，再次感染组鱼局部及血清中均产生升高水平之特异性IgM，但未观察到明显克隆选择（clonal selection）。上述发现深化了对硬骨鱼（teleost）黏膜免疫记忆的理解，并揭示鳃在二次应答期间可作为局部适应性免疫调控部位。
论文解读：
本文发表于《Frontiers in Immunology》，研究背景如下：鱼类黏膜表面（鳃、皮肤、肠道）是抵御环境病原的第一道防线，但鱼类黏膜缺乏哺乳动物那样具有明确结构的黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue, MALT），其鳃相关淋巴组织（gill-associated lymphoid tissue, GIALT）中免疫细胞呈弥散分布，鲑科鱼类鳃中还存有较为有序的鳃间淋巴组织（interbranchial lymphoid tissue, ILT）。既往研究表明初次感染可激活鳃固有及适应性免疫，但鳃能否对二次感染产生局部记忆应答（即是否存在黏膜免疫记忆及二次应答时炎症减弱、适应性免疫增强的特征）尚无报道。硬骨鱼拥有三种免疫球蛋白——IgM、IgD和IgT（或IgZ），其中IgT拥有独立的V(D)J重排且形成独立B细胞谱系，在黏膜免疫中发挥重要作用。明确鳃局部是否可介导二次适应性免疫记忆对水产养殖黏膜疫苗研发具重要意义。为此，研究人员以格氏乳球菌（Lactococcus petauri，致虹鳟乳球菌病的主要病原）为模型，通过浸浴法建立初次—再次感染实验，采集鳃组织及血清，综合应用转录组学、B细胞受体（B cell receptor, BCR）高通量测序及免疫细胞功能检测手段，探究虹鳟鳃对细菌二次攻击的局部免疫应答特征。研究得出结论：鳃可对二次感染产生与初次感染截然不同的局部应答——初次感染以强烈炎症反应为主，再次感染则下调炎症基因此而上调适应性免疫（特别是B细胞功能相关基因）及特定趋化因子受体、Toll样受体基因，并伴有IgM和IgT BCR库克隆扩增及局部与血清特异性IgM升高，表明鳃具备局部黏膜免疫记忆特征。
主要关键技术方法：选用平均体重约43.1 g的虹鳟（Oncorhynchus mykiss）幼鱼，设四组——全程模拟感染对照（CC组）、仅第二次感染（CI组，初次应答）、仅第一次感染（IC组，远期效应对照）、两次均感染（II组，二次/再次应答）；格氏乳球菌（Lactococcus petauri）浸浴攻毒（1×1012 CFU/mL，2.5 h），二次攻毒于初次感染后第30天进行，二次攻毒后第4天采样。主要技术手段包括：(1) 鳃组织总RNA提取后进行Illumina DNBSEQ-G400平台双端150 bp转录组测序（RNAseq），用HISAT2比对至虹鳟参考基因组（USDA_OmykA1_1, GCF_013265735.2），DESeq2进行差异基因表达分析（FDR＜0.05, |log?FC|≥1）；(2) 基于模板转换（template switching）及唯一分子标识符（unique molecular identifier, UMI）的5′ RACE建库，对鳃IgM与IgT重链可变区V(D)J进行Illumina NextSeq 2000高通量测序（next generation sequencing, NGS），经PEAR合并、UMI共识序列生成及IMGT/HighV-QUEST比对分析BCR库多样性、克隆大小分布、V/D/J基因片段使用及互补决定区3（complementarity-determining region 3, CDR3）长度谱型（spectratyping）；(3) 鳃白细胞分离后经抗IgM包被ELISpot检测总及格氏乳球菌特异性IgM分泌细胞数；(4) 血清格氏乳球菌包被间接ELISA检测特异性IgM效价。
研究结果如下：
3.1 Transcriptional response of the gills to L. petauri primary and secondary infections（鳃对格氏乳球菌初次及二次感染的转录应答）：主成分分析显示CI组（初次近期感染）基因表达离散度大，II组（再次感染）与CC、IC组各自聚类良好。差异表达基因分析发现CI组显著上调大量炎症、补体（C1、C3、C4B、C6、C7B等）、促炎细胞因子（il1β、il8/cxcl8、il11、il15等）、趋化因子（cxcl13、ccl19/ccl19a等）及其受体基因，而IC组（初次感染34 d后采样）与CC组无显著差异，说明初次感染诱导的转录效应不长期维持。II组与CI组相比，大多数炎症及细胞因子基因未上调，反而显著上调B细胞功能相关基因——包括igdh1、多个IgM重链可变区片段、ight3及κ/λ样轻链，以及T细胞功能相关基因tbx21（编码T-bet）和cd28；此外趋化因子受体基因ccr5与cxcr3、Toll样受体基因tlr13在II组表达显著高于其余各组。表明二次感染鳃局部转向以适应性免疫基因为主的应答模式并伴特定招募/识别分子上调。
3.2 IgM and IgT VDJ rearrangements in the gills（鳃中IgM与IgT VDJ重排分析）：以独特连接序列类型（junction sequence type, JST，定义为特定VHDHJH重排及对应CDR3氨基酸序列）统计BCR库多样性，II组IgM与IgT的独特JST数量均为各组中最高（IgM II组显著高于CC与CI组；IgT II组显著高于CI与IC组），提示二次感染引起BCR库多样性增加。克隆大小分布分析显示各组中均含未扩增（出现1次）及不同扩增程度JST，II组IgM中出现11–50次重复序列的频率高于CI组，IgT中单次出现JST频率II组高于CI组，未见典型单克隆优势扩增。VH、D、JH基因片段使用在各组间整体相似（IgM偏好IGHV1/6/11及IGHD1、IGHJ3；IgT偏好自身D段IGHD2T1D/IGHD2T2/IGHD1T2及IGHJ1T2），少数片段（IGHV11、IGHD3D、IGHD1T2、IGHD6）使用率存在组间差异但不构成特定克隆选择证据。
3.3 CDR3 spectrotyping of IgM and IgT sequences in gills（鳃IgM与IgT序列CDR3长度谱型分析）：IgM与IgT各组的CDR3长度频率分布均偏离正态分布（IgM最频长约10个氨基酸，IgT略长），各组间CDR3长度分布无显著差异，未出现典型克隆选择所致的谱型扭曲，与已知黏膜组织基线已具抗原经验B细胞导致的非高斯分布特征相符。
3.4 L. petauri-specific IgM production（格氏乳球菌特异性IgM的产生）：ELISpot显示II组鳃白细胞中格氏乳球菌特异性IgM分泌细胞数显著高于CC组，总IgM分泌细胞数各组无显著差异。血清ELISA显示II组格氏乳球菌特异性IgM吸光度值显著高于CC、CI及IC组，证实二次感染后在局部鳃及全身水平均出现特异性体液免疫增强。
讨论与结论翻译总结：硬骨鱼二次免疫应答是否类同哺乳动物尚存争议，此前未见黏膜组织二次应答研究。本研究首次证明虹鳟鳃对格氏乳球菌二次攻毒呈现与初次感染不同的局部应答模式——初次感染以广泛炎症、补体及细胞因子基因上调为特征，而二次感染炎症相关基因不上调，适应性免疫（尤其B细胞Ig重链及轻链基因）及ccr5、cxcr3、tlr13基因上调，提示局部已存在经初次致敏后更易活化之淋巴细胞群体（可能为局部驻留记忆B/T细胞或受系统性记忆影响之局部反应）。BCR库分析显示二次感染致IgM与IgT独特JST数增加及克隆多样性升高，但无明确克隆选择（CDR3谱型无明显偏移、V/D/J使用无偏向性优势），符合黏膜已具抗原经验B细胞背景下之克隆扩增而非经典克隆选择模式。IgD转录水平在二次感染中未被特异性诱导。综上，本研究证实虹鳟鳃可介导局部二次适应性免疫应答特征，为鱼类黏膜免疫记忆提供实证，对优化水产养殖用黏膜疫苗具重要参考价值；鳃中驻留记忆B/T细胞之确切表型及ILT在二次应答中之角色尚需进一步阐明。
