《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Extracellular vesicles as nanocarriers in glioblastoma: implications for chemoresistance and immune evasion
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胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM) 是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，因其显著的肿瘤内异质性、适应性可塑性和复杂的肿瘤微环境而对传统治疗高度抵抗。越来越多的证据表明，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs) 在介导GBM细
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM) 是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，因其显著的肿瘤内异质性、适应性可塑性和复杂的肿瘤微环境而对传统治疗高度抵抗。越来越多的证据表明，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs) 在介导GBM细胞间通讯中发挥核心作用，并参与多种与治疗抵抗相关的机制。本综述批判性地审视了GBM来源EVs的生物发生、分子货物组成和功能异质性，特别侧重于其在化疗耐药相关过程中的作用，包括凋亡逃逸、DNA修复调控、干性维持、免疫重编程、代谢适应和肿瘤微环境重塑。EV相关货物，包括微小RNA（microRNAs, miRNAs)、长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs)、环状RNA（circular RNAs, circRNAs)、蛋白质和脂质，在治疗压力下协同调控相互关联的耐药网络，而非通过孤立通路发挥作用。重要的是，本综述区分了体外系统、临床前体内模型和患者来源临床证据中的发现，以更好地阐明基于EV的机制当前的转化相关性。新出现的证据进一步表明，EV介导的效应可能具有情境依赖性，在某些情况下可能发挥非经典或抗增殖功能。除了其病理作用外，EVs作为GBM管理的潜在生物标志物和治疗平台也受到越来越多的研究关注。然而，重大的转化障碍仍然存在，包括EV异质性、缺乏分离标准化、可扩展性限制、货物装载效率低下、监管挑战以及对脱靶效应和生理效应的不完全理解。通过将机制见解与转化考虑相结合，本综述提供了一个平衡的框架，用于理解EVs在GBM进展和治疗抵抗中的双重和情境依赖性作用，同时强调了临床实施前必须解决的关键知识空白。
本综述系统阐述了细胞外囊泡（EVs) 在胶质母细胞瘤（GBM) 生物学及治疗抵抗中的多重角色，涵盖其生物发生机制、分子货物组成、功能异质性，以及在化疗耐药和免疫逃逸中的核心作用，并探讨了基于EV的治疗策略及转化挑战。
**GBM的异质性与治疗挑战**
GBM表现出深刻的异质性，由内在和外在因素共同塑造，包括遗传多样的克隆和亚克隆肿瘤群体、胶质瘤干细胞样细胞（GSCs) 以及肿瘤微环境（TME) 组分。肿瘤内异质性主要源于细胞起源和驱动肿瘤进展的遗传与表观遗传改变，这些内在改变产生了多种细胞状态和表型特征。肿瘤间异质性则进一步受到TME来源的外在影响，包括免疫组成、基质相互作用和缺氧微环境。基于基因表达谱分析，GBM可分为三种主要分子亚型：前神经型（Proneural, PN)、间充质型（Mesenchymal, MES) 和经典型（Classical, CL)，分别与PDGFRA和IDH1改变（PN)、EGFR扩增（CL) 以及NF1缺失（MES) 相关。表观遗传机制，包括染色质重塑、组蛋白修饰和DNA甲基化，在塑造GBM动态基因表达模式中发挥核心作用。重要的是，GBM亚型并非静态不变，肿瘤细胞在治疗和微环境压力的驱动下，通过转录和表观遗传可塑性在不同细胞状态间发生动态转换。GSCs因其自我更新、多向分化和显著细胞可塑性而被认为是GBM侵袭性的关键贡献者。治疗压力进一步重塑GBM景观，促进耐药克隆的出现。单细胞RNA测序研究揭示了TME中免疫细胞组成的显著患者间变异性。
**EVs在GBM异质性中的通讯作用**
GBM异质性部分受到EVs介导的肿瘤-微环境相互作用的调控。通过自分泌和旁分泌信号，EVs促进TME内的双向通讯，从而促进动态肿瘤演化。致癌货物如EGFRvIII可通过EVs传递，与受体酪氨酸激酶信号调控及更具侵袭性表型的获得相关。EV介导的miRNAs转移已被证实可调节肿瘤细胞行为，包括增殖、侵袭和治疗反应；然而这些效应具有情境依赖性，在不同实验模型中存在差异。GSCs与其他肿瘤亚群之间的EV相关miRNAs交换可影响分子和表型多样性，潜在增强GBM内的细胞可塑性。
**EVs在细胞间通讯中的作用**
EVs通过向受体细胞转移蛋白质、核酸、脂质和代谢物等生物活性货物，在生理和病理条件下促进细胞间通讯。EVs可通过内吞作用、膜融合以及配体-受体相互作用等多种机制与靶细胞相互作用，但各通路的相对贡献因细胞类型和情境而异。这些相互作用使EVs能够影响细胞内信号通路和细胞功能，包括基因表达和代谢活性。
**癌细胞中EV的形成**
EVs是纳米级膜结合囊泡，基于其生物发生和大小可分为外泌体（exosomes)、微泡（microvesicles) 和凋亡小体（apoptotic bodies)；然而由于特征重叠和分离技术的局限性，在许多实验背景下清晰区分这些亚型仍具挑战性。肿瘤细胞通常比非恶性细胞表现出更高的EV分泌水平。在体外培养中，单个胶质瘤细胞可在48小时内释放约~10,000个EVs。这些囊泡能够双向穿越血脑屏障，并在外周生物流体中被检测到，支持其作为循环生物标志物的潜力。GBM来源的EV货物反映了肿瘤内在特征和微环境影响，含有IL-10、TGF-β、热休克蛋白和PD-L1等多种免疫调节分子。不同GSC亚型释放的EVs具有不同的分子谱：间充质GSC来源的EVs富集CD9、CD63和CD81等四跨膜蛋白，而前神经GSC来源的EVs则显示这些经典标志物表达降低。选择性包装信号分子使GSCs能够影响周围细胞并重塑TME，如VEGF-A的囊泡运输可增强内皮通透性和血管生成，Notch1的转移则可促进受体胶质瘤细胞的干性和致瘤性。
**GBM中EV的货物**
GBM来源的EVs携带多样化的生物活性货物，包括蛋白质、DNA、RNA、脂质和代谢物，在多个实验系统中与肿瘤进展、治疗抵抗和微环境重塑相关。
**GBM-EV RNAs在化疗耐药中的作用**
EV相关非编码RNA（ncRNAs) 通过凋亡抑制、DNA修复调控、干性维持、存活信号通路激活以及化疗和放疗抵抗等相互关联机制促进GBM进展和治疗抵抗。
微小RNA（miRNAs) 是关键的转录后调控因子，可影响细胞周期控制、药物代谢、凋亡、DNA修复和TMZ反应中的主要致癌信号通路。例如，miR-21在慢性TMZ暴露产生的耐药GBM细胞中上调，其抑制可增加凋亡并增强TMZ诱导的细胞毒性；miR-139直接靶向抗凋亡蛋白Mcl-1，其过表达可抑制增殖并增强TMZ诱导的凋亡；miR-143通过靶向N-RAS抑制下游PI3K/AKT、MAPK/ERK和NF-κB相关信号，恢复其表达可增强TMZ诱导的凋亡。miR-1238在TMZ耐药GBM细胞来源的EVs中富集，可通过调控CAV1/EGFR信号轴激活下游EGFR-PI3K-Akt-mTOR通路促进耐药。exosomal miR-221通过靶向DNM3促进胶质瘤进展和TMZ耐药；exosomal miR-25-3p通过靶向FBXW7增加c-Myc和cyclin E表达促进耐药。exosomal miR-151a则具有化疗增敏作用，其恢复可抑制XRCC4介导的DNA修复，增加DNA损伤并增强TMZ诱导的凋亡。缺氧诱导的miR-301a可抑制TCEAL7并激活Wnt/β-catenin信号，与辐射敏感性和治疗有效性相关。缺氧GSC来源的EVs中，miR-30b-3p由HIF1α和STAT3转录诱导，通过与hnRNPA2B1相互作用促进选择性EV装载和转移，直接靶向RHOB减少凋亡并增强增殖。exosomal miR-27a-3p通过靶向BTG2促进TMZ耐药。
长链非编码RNA（lncRNAs) 通过多个相互关联的功能轴促进TMZ耐药：DNA损伤修复调控、增殖和上皮-间充质转化（EMT) 调控、存活和炎症信号通路激活、以及TME和免疫反应重塑。lncRNA SBF2-AS1作为miR-151a-3p的竞争性内源RNA（ceRNA)，解除对XRCC4的抑制，促进DNA双链断裂修复；lncRNA HOTAIR在TMZ耐药GBM细胞中显著上调，通过miR-519a-3p/RRM1通路和miR-526b-3p/EVA1信号促进增殖、侵袭和EMT；lncRNA H19在氧化应激条件下被诱导，通过激活NF-κB信号通路促进TMZ耐药；MALAT1通过促进多药耐药（MDR) 相关基因表达和EMT促进化疗耐药；SNHG15调控miR-627-5p/CDK6轴，促进增殖、血管生成和免疫抑制微环境改变，其沉默可恢复TMZ敏感性并减少小胶质细胞M2极化；ADAMTS9-AS2通过激活FUS/MDM2信号轴促进TMZ耐药；lnc-TALC通过miR-20b-3p海绵化激活STAT3/p300复合物，上调MGMT表达，还可被包装入外泌体转移至小胶质细胞促进M2极化。
环状RNA（circRNAs) 通过竞争性内源RNA机制调控TMZ耐药。circ_0072083通过海绵化miR-1252-5p增加NANOG表达增强干性；circ_0043949在继发性TMZ耐药GBM组织中显著上调；circCABIN1通过海绵化miR-637上调OLFML3激活ErbB信号通路；circ-HIPK3通过调控miR-421/ZIC5轴促进TMZ耐药；circWDR62通过海绵化miR-370-3p上调MGMT增强DNA修复能力。
**GBM-EVs的蛋白质组分**
GBM-EVs携带多种蛋白质，促进肿瘤-宿主相互作用、免疫调节、血管生成和治疗抵抗。免疫抑制介质包括galectin-9、IDO和TGF-β；血管生成相关蛋白包括VEGF、MMP9、EGFR、PDGFR等；CD44和CD133等表面标志物与化疗耐药和疾病进展相关；缺氧条件下MCT1和CD147富集增强代谢适应和侵袭能力；GSC来源的EVs含有腺苷产生酶激活MDR通路；ABCB4通过EVs从GSCs传递至分化胶质瘤细胞增强TMZ耐药；MGMT和APNG相关转录本富集的外泌体促进烷化剂诱导DNA损伤的修复；Notch1蛋白转移促进血管生成、免疫抑制和ECM重塑。
**GBM-EVs的脂质组成**
GBM-EVs富集特定脂质类别，包括饱和脂肪酸、鞘磷脂和鞘氨醇-1-磷酸（S1P)，反映GBM中改变的鞘脂代谢。GSC来源的小EVs富含饱和脂肪酸和脂质及能量代谢相关代谢物，甘油和2,2-二甲基丙烷-1,3-二醇等代谢物与膜重塑和细胞能量平衡的甘油磷脂代谢通路相关。
**GBM治疗中的挑战与EV介导的耐药**
TMZ通过DNA碱基甲基化发挥细胞毒性作用，但MGMT过表达、碱基切除修复（BER) 通路激活、适应性自噬、GSC相关存活程序和药物外排活性等导致耐药。膜相关药物转运和EV介导的药物外排也促进TMZ耐药，如PTRF/Cavin1-caveolin-1信号轴破坏减少小EV分泌并增强细胞内药物积累；氯喹抑制自噬和EV释放具有TMZ增敏效应。血脑屏障（BBB) 和血-脑肿瘤屏障（BBTB) 的持续存在限制有效药物递送。EV为基础的递送系统因其固有多样性、肿瘤靶向潜力和穿越BBB能力而成为有前景的治疗平台，但仍面临大规模生产、货物异质性、生物分布控制和长期安全性评估等挑战。
**肿瘤微环境改变与GBM中的化疗耐药**
EVs通过动态重塑TME促进GBM化疗耐药，包括免疫抑制、血管生成、ECM重塑和基质细胞重编程。GBM-EVs与巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和T淋巴细胞相互作用，建立免疫抑制性TME；缺氧条件增强TAM向M2样表型极化。CSC来源的EVs通过VEGFA、VEGF-C、EGFRvIII和Cx43等促进血管生成；EV介导的GBM细胞与星形胶质细胞通讯促进肿瘤支持性微环境；GBM-EVs诱导MSC向CAF样表型重编程。
**EVs与免疫调节**
GBM-EVs通过转移免疫调节蛋白、细胞因子、脂质和核酸重塑免疫细胞表型和功能。主要免疫抑制机制包括：EV相关PD-L1与PD-1相互作用抑制T细胞；galectin-9通过TIM-3抑制DC抗原呈递；CD39/CD73促进细胞外腺苷积累；免疫抑制性miRNAs（miR-21、miR-29a、miR-92a、miR-1246、miR-10a) 建立"免疫抑制光环"。巨噬细胞和微胶质细胞被RAC1/AKT/NRF2和TREM1/SYK-PDK-STAT3等通路重编程为M2样表型；MDSCs通过ARG1活性、免疫检查点信号和细胞因子分泌被诱导；DCs的抗原呈递能力受损；NK细胞功能被TGF-β抑制；T细胞和Tregs功能受多种机制抑制；B细胞被诱导分化为调节性B细胞（Bregs)。
**EVs的治疗靶向**
抑制EV释放的策略包括：nSMase2抑制剂（GW4869、manumycin A、DPTIP 2,6-Dimethoxy-4-(5-Phenyl-4-(Thiophen-2-yl)-1H-Imidazole-2-yl)Phenol)、glibenclamide、imipramine、simvastatin、dimethyl amiloride、ketoconazole、omeprazole、cannabidiol等；RNA干扰和CRISPR-Cas9系统调节ESCRT机制组分；靶向Rab27a/Rab27b调控MVB运输和融合。然而，非选择性抑制EV生物发生可能破坏正常细胞稳态，且EV群体的异质性、低靶向效率、快速清除、非特异性摄取等问题限制其临床应用。
**基于EV的生物标志物**
EVs作为液体活检分析物具有吸引力，因其可保护分子货物免受酶解降解，并能穿越BBB。EV浓度、大小分布和ncRNA特征可能与疾病进展、复发和放化疗反应相关。然而，肿瘤特异性EV标志物的识别、分离纯化标准化、低产量、短循环半衰期和前处理变异性等限制了其常规临床应用。
**转化挑战和临床规模障碍**
主要障碍包括：缺乏GMP合规生产系统；EV异质性影响治疗效力和靶向特异性；分离方法（超速离心、沉淀法、尺寸排阻色谱) 产生不同纯度谱和污染物水平；物理装载策略可能损害囊泡膜完整性；快速被单核吞噬细胞系统（肝脾) 清除；表面修饰和基因工程可能引入免疫原性和毒理学不确定性；FDA和EMA等监管机构缺乏统一的质量控制基准、标准化参考材料和共识性功能检测；MISEV推荐虽已强调标准化需求，但方法学差异仍阻碍监管协调和大规模商业化。
