《Frontiers in Pharmacology》：Gastrodin alleviates cardiomyocyte senescence by regulating autophagy through the AMPK/mTOR/4EBP1 pathway
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摘要目的：探讨天麻素（Gastrodin, Gas）是否通过调控AMPK/mTOR/4EBP1信号通路及自噬相关过程，减轻多柔比星（Doxorubicin, Dox）诱导的心肌细胞衰老和凋亡。方法：建立Dox诱导的H9c2心肌细胞衰老模型，采用不同浓度Gas（
摘要目的：探讨天麻素（Gastrodin, Gas）是否通过调控AMPK/mTOR/4EBP1信号通路及自噬相关过程，减轻多柔比星（Doxorubicin, Dox）诱导的心肌细胞衰老和凋亡。方法：建立Dox诱导的H9c2心肌细胞衰老模型，采用不同浓度Gas（0.5 mM和1 mM）进行干预。通过SA-β-gal染色及衰老相关蛋白（P16、P21和P53）评估衰老表型。此外，应用自噬抑制剂3-MA和AMPK抑制剂Compound C（CC）。结合Western blotting、Annexin V/PI流式细胞术及免疫荧光技术，分析衰老相关蛋白、自噬相关标志物（LC3-II/I、Beclin-1和p62）以及AMPK/mTOR/4EBP1信号通路关键蛋白磷酸化水平的表达变化，以探索Gas的潜在机制。结果：与Dox模型组相比，Gas干预剂量依赖性地降低SA-β-gal阳性细胞百分比，下调P16、P21、P53和γ-H2AX蛋白表达水平，并显著抑制凋亡。机制上，Gas处理部分改善了Dox诱导的自噬相关标志物异常，表现为LC3和Beclin-1表达增加及p62积聚减少，且该改善作用被3-MA部分削弱。进一步信号通路分析显示，Gas显著提高p-AMPK/AMPK比值，同时降低p-mTOR/mTOR和p-4EBP1/4EBP1比值。经CC抑制AMPK后，Gas对自噬的激活作用及其对衰老和凋亡的保护作用均被削弱。结论：这些发现表明，Gas可减轻Dox诱导的心肌细胞衰老和凋亡，其保护作用可能与调控AMPK/mTOR/4EBP1信号通路及改善自噬相关过程有关。
心血管疾病仍是全球首位死因。据世界卫生组织统计，2022年全球约有1980万人死于心血管疾病，约占全球总死亡人数的32%。随着人口老龄化加剧，心脏衰老已成为老年心血管事件如心力衰竭的重要生物学基础。衰老心脏在结构和功能上均发生退行性变化，包括心肌细胞衰老、血管顺应性下降及慢性低度炎症。当前临床管理主要聚焦于危险因素控制和并发症管理，尽管这些策略可改善预后，但针对心脏衰老机制本身的可逆性干预策略仍相对有限。
细胞衰老是驱动心脏衰老的核心机制之一。虽然心肌细胞属于终末分化细胞，但在衰老或病理应激条件下仍可表现出衰老样表型，其特征为SA-β-gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）活性增加及衰老相关蛋白P16、P21和P53表达上调。这些改变共同破坏心肌微环境，促进心功能下降和心力衰竭进展。自噬（autophagy）作为维持细胞内稳态的关键过程，在心血管衰老过程中总体呈下降趋势。年龄相关自噬障碍与心血管结构重塑和功能恶化同时发生，提示恢复自噬稳态可能成为干预心肌细胞及心脏衰老表型的重要机制切入点。
天麻素（Gastrodin, Gas）是天麻的主要活性成分，在多种衰老相关模型中显示出抗氧化、抗炎和抗衰老作用。研究表明Gas可延长果蝇寿命、增强抗氧化酶活性并提高氧化应激抵抗能力，提示其在延缓衰老方面的潜在作用。此外，Gas在衰老相关疾病模型中通过调控线粒体功能、抑制炎症通路及改善神经退行性变等机制发挥保护作用。前期研究发现Gas在秀丽隐杆线虫中显示出延长寿命的趋势，进一步初步实验结果表明Gas显著改善动物模型中自噬相关标志物异常并促进AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）磷酸化水平上调，提示其可能通过调控以AMPK为中心的能量感应信号通路参与衰老相关过程的调节。基于上述发现，研究人员假设Gas通过激活AMPK、抑制下游mTOR/4EBP1信号通路从而调控自噬相关过程，发挥对抗Dox诱导的心肌细胞衰老的保护作用。为验证该假设，研究人员采用Dox诱导的H9c2心肌细胞衰老模型，系统评价Gas对衰老表型、凋亡、自噬活性及AMPK/mTOR/4EBP1通路的影响，并进一步采用药理学抑制剂进行功能验证，旨在为靶向心肌衰老的天然产物干预提供新的实验证据和机制见解。
本研究使用大鼠H9c2心肌细胞系作为实验细胞来源，该细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。主要关键技术方法包括：SA-β-gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）染色用于检测细胞衰老表型；免疫荧光技术用于检测P16、P21、P53、γ-H2AX及LC3等蛋白的定位和表达；Western blotting用于检测衰老相关蛋白（P16、P21、P53、γ-H2AX）、自噬相关标志物（LC3-II/I、Beclin-1、p62）及AMPK/mTOR/4EBP1信号通路关键蛋白的磷酸化水平；Annexin V/PI流式细胞术用于检测细胞凋亡率；此外，采用自噬抑制剂3-MA（3-甲基腺嘌呤，5 mM）和AMPK抑制剂Compound C（CC，10 μM）进行药理学功能验证。
研究结果部分，"天麻素剂量依赖性地抑制Dox诱导的细胞衰老"：通过SA-β-gal染色发现，与对照组相比，Dox处理显著增加衰老相关蓝色沉淀形成，而0.5 mM和1 mM Gas处理后蓝色沉淀显著减少，1 mM Gas效果更为明显。免疫荧光和Western blot分析显示，Dox刺激显著增加P16、P21、P53荧光强度和蛋白表达水平，Gas处理后其表达水平剂量依赖性降低，且1 mM Gas组降低更为显著。此外，Dox处理后DNA损伤相关衰老标志物γ-H2AX表达显著增加，Gas干预明显降低其表达水平。这些结果表明Gas有效缓解Dox诱导的H9c2细胞衰老。
"自噬抑制剂3-MA逆转天麻素的抗衰老和抗凋亡作用"：流式细胞术结果显示，与对照组相比，模型组凋亡率显著增加，Gas处理显著降低凋亡率，而Gas+3-MA共处理组较Gas组凋亡率显著升高，表明3-MA部分阻断Gas的抗凋亡作用。免疫荧光和Western blot结果一致显示，Gas与3-MA共处理时，Gas诱导的P16、P21、P53下调被显著逆转，γ-H2AX表达较Gas组显著增加。这些发现表明自噬相关过程可能参与Gas介导的抗衰老和抗凋亡效应。
"自噬抑制剂3-MA削弱天麻素对自噬相关蛋白的调控作用"：免疫荧光结果显示各组LC3相关荧光信号强度和分布存在差异，Dox组LC3信号减少，Gas处理后增强，3-MA处理部分削弱Gas诱导的变化。Western blot显示Gas部分改善Dox诱导的p62积聚及Beclin-1和LC3表达异常，而3-MA部分逆转Gas对这些自噬相关蛋白的调控作用。这些发现提示Gas可能参与调控Dox损伤心肌细胞的自噬相关过程，而3-MA部分拮抗该效应。
"AMPK信号通路参与天麻素的细胞保护作用"：流式细胞术显示AMPK抑制剂CC单独处理对凋亡率无显著影响，但Gas+CC共处理组较Gas组凋亡率显著增加，表明抑制AMPK通路拮抗Gas的抗凋亡作用。免疫荧光和Western blot显示Gas与CC共处理显著逆转Gas诱导的P16、P21、P53和γ-H2AX表达下调，提示Gas通过激活AMPK信号通路抑制衰老相关蛋白表达。
"AMPK抑制剂CC部分逆转天麻素对自噬的调控作用"：Western blot显示CC显著抑制Gas诱导的LC3-II表达增加，免疫荧光作为形态学补充。这些发现提示Gas的保护作用部分依赖于AMPK介导的自噬相关过程调控。
"天麻素通过AMPK/mTOR/4EBP1通路恢复Dox诱导的信号失衡"：与对照组相比，Dox模型组AMPK磷酸化水平显著降低，而mTOR及其下游靶点4EBP1的磷酸化水平显著升高。Gas处理后这些改变被逆转，表现为p-AMPK表达上调及p-mTOR和p-4EBP1水平下调。但在Gas+CC共处理组中，Gas对这些磷酸化事件的调控作用被显著逆转。这些结果表明Gas特异性激活AMPK同时抑制其下游mTOR/4EBP1信号通路，CC阻断Gas的调控效应，证实AMPK/mTOR/4EBP1信号通路是Gas介导自噬激活和细胞保护的关键上游调控轴。
讨论部分，研究人员指出心脏衰老是年龄相关心血管事件负担增加的关键生物学基础之一，当前治疗策略主要集中于控制危险因素和终末表型，而针对衰老机制本身的干预仍相对有限。天麻素作为天麻主要活性成分，已有报道显示其通过促进自噬流、改善线粒体功能和增强细胞存活等机制，在缺血再灌注和氧化应激诱导的心肌损伤模型中发挥保护作用，提示其作为心肌细胞抗衰老干预候选药物具有相当潜力。
SA-β-gal染色是识别应激诱导或复制性衰老细胞的经典组织化学标志物。P16和P21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，维持视网膜母细胞瘤蛋白（RB）低磷酸化状态并抑制G1/S转换，从而强化和维持不可逆的细胞周期阻滞。P53是DNA损伤应答和应激信号的中心转录因子，其持续激活诱导下游效应分子如p21，促进衰老程序建立。γ-H2AX是DNA双链断裂后形成的关键DNA损伤应答标志物，其持续积聚表明持续DNA损伤和DNA损伤应答激活，被认为是衰老过程中基因组不稳定性和DNA损伤积聚的重要分子指标。本研究中Dox诱导H9c2细胞明显衰老样变化，表现为SA-β-gal阳性细胞比例增加及P16、P21、P53和γ-H2AX表达上调，伴随凋亡增加和细胞活力下降，提示Dox同时激活与DNA损伤、细胞周期阻滞和凋亡相关的应激反应。Gas剂量依赖性地改善Dox诱导的衰老相关表型，同时减少凋亡并增加细胞活力，显示其对Dox诱导心肌细胞损伤的综合保护作用。由于细胞衰老和凋亡在持续应激条件下可能共享部分上游调控机制，Gas对两者的同步改善可能提示其作用于应激损伤和能量代谢失衡等更上游环节。
自噬稳态破坏被认为是促进心肌细胞衰老和功能衰退的关键机制。LC3、Beclin-1和p62为关键自噬相关标志物，LC3-II水平常用于反映自噬相关变化，但其单独增减无法区分自噬诱导增强与自噬降解受阻。Beclin-1表达降低一般提示自噬启动受损，p62积聚通常被认为是自噬降解受损的间接指标，但其表达也可能受转录调控影响。本研究中Dox处理导致LC3和Beclin-1表达降低伴随p62积聚，提示存在自噬相关异常，但尚不足以明确区分自噬启动抑制与后期流受损。Gas部分纠正这些自噬相关标志物异常，同时改善衰老和凋亡表型。更重要的是，引入自噬抑制剂3-MA后，Gas减少凋亡和下调衰老标志物的保护作用被部分削弱，LC3、Beclin-1和p62表达的改善也被减弱，提示自噬相关过程可能参与Gas介导的保护作用。
机制上，AMPK通过抑制mTORC1（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1）促进自噬相关过程，是能量应激条件下的关键适应性反应。近年来，AMPK活性下降与心脏衰老、线粒体功能障碍及年龄相关能量代谢失衡相联系，因此AMPK也被视为延缓心肌衰老的重要潜在干预靶点。4EBP1是真核翻译起始因子4E结合蛋白1，为mTORC1经典下游效应因子，其磷酸化水平变化可反映mTORC1激活状态。AMPK抑制剂Compound C削弱Gas对凋亡率、衰老标志物和自噬指数的保护作用，共同支持AMPK/mTOR/4EBP1通路可能参与Gas介导的保护。通路分析显示Dox降低p-AMPK/AMPK比值，同时升高p-mTOR/mTOR和p-4EBP1/4EBP1比值，Gas处理部分恢复AMPK磷酸化并抑制mTOR和4EBP1过度磷酸化，而CC的加入在不同程度上削弱这些改善作用。药理学拮抗结果与磷酸化变化揭示的通路激活方向共同提示，Gas的保护作用可能与该通路的调控有关。
研究结论为：本研究证明天麻素显著缓解Dox诱导的心肌细胞衰老和凋亡，伴随自噬相关标志物异常的改善。机制上，该效应与AMPK激活及mTOR/4EBP1信号轴抑制相关，且AMPK抑制剂和自噬抑制剂均部分削弱Gas的保护作用，提示AMPK/mTOR/4EBP1通路及自噬相关过程可能参与其作用机制。总之，天麻素可能通过AMPK/mTOR/4EBP1信号通路调控自噬相关过程，从而减轻Dox诱导的心肌细胞衰老及相关损伤，为天然活性成分干预心脏衰老提供了新的实验证据。该论文发表于《Frontiers in Pharmacology》。
