源自自身免疫干燥眼小鼠的肠道菌群移植在泪腺( lacrimal gland, LG )印刻定型B细胞受体(B cell receptor, BCR)库并诱导疾病发生

《Frontiers in Immunology》：Gut microbiota transfer from autoimmune dry eye mice imprints stereotypic B cell receptor repertoires in the lacrimal gland and induces disease

　　

摘要：已有研究提示肠道菌群与体液免疫在舍格伦综合征（Sj?gren disease, SjD）发病中发挥重要作用，但其具体机制尚不明确。本研究将SjD样自身免疫干眼病模型小鼠的肠道菌群通过粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation, FMT）转移至C57BL/6（B6）小鼠，随后对受者肠道微生物组组成、临床眼表表型及B细胞受体（B cell receptor, BCR）库进行表征。研究发现，NOD-FMT小鼠肠道菌群发生显著改变，并伴有SjD样临床特征，包括角膜荧光素染色（corneal fluorescein staining, CFS）评分升高、泪液分泌减少、白细胞介素（interleukin, IL）-6 mRNA水平上调及黏蛋白（mucin, MUC）5AC mRNA水平下调。此外，NOD-FMT小鼠泪腺（lacrimal gland, LG）及脾脏中定型（stereotypic）BCR克隆型在个体间的共享频率显著高于对照组。编码这些定型克隆型的大部分B细胞克隆在泪腺局部发育扩增，部分亦进入外周循环呈现全身分布。上述结果揭示了一条肠-眼免疫轴（gut–ocular immune axis），即菌群移植可诱导具定型特征、并可系统性播散的BCR克隆型产生，参与自身免疫性干眼病的免疫发病机制。

论文解读：源自自身免疫干燥眼小鼠的肠道菌群移植在泪腺印刻定型B细胞受体库并诱导疾病发生

本文由研究人员发表于《Frontiers in Immunology》。舍格伦综合征（Sj?gren disease, SjD）是一种以外分泌腺淋巴细胞浸润为特征的慢性自身免疫病，常伴有干眼症状。既往证据表明肠道菌群失调（dysbiosis）与SjD相关，且可通过肠-眼-泪腺（lacrimal gland, LG）-微生物组轴参与干眼病发生，但菌群失调在SjD发病中的确切作用及特定微生物类群对干眼的加剧或缓解效应尚不清楚。体液免疫在自身免疫病进展中起核心作用，SjD患者血清中常检出靶向外分泌腺的自身抗体，然而SjD中B细胞受体（B cell receptor, BCR）库的组成及其与 microbiome的关联仍鲜有探讨。为此，研究人员采用SjD样自身免疫干眼模型NOD.B10.H2^b小鼠为供体，将其粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation, FMT）至免疫健全的C57BL/6（B6）受体小鼠，通过评估受体临床表型、16S rRNA测序分析肠道菌群变化，以及BCR高通量测序分析LG与脾脏BCR库特征，探究肠菌失调与眼炎症及BCR库改变的关系。研究证实FMT可传递SjD样干眼表型，重塑受体肠道菌群，并在LG及全身诱导定型BCR克隆型扩增与播散，揭示了菌群驱动的肠-眼免疫轴在自身免疫干眼免疫病理中的作用。

主要关键技术方法：

研究以30只≥20周龄NOD.B10.H2^b自发自身免疫干眼模型小鼠为FMT供体，10只5周龄C57BL/6（B6）雄鼠为NOD-FMT受体组（抗生素预处理后灌胃供体粪菌悬液3周），9只B6小鼠为PBS灌胃对照（PBS-T组）；部分未处理B6小鼠作为BCR库对照。采集FMT前后粪便行16S rRNA V3–V4区扩增子测序分析菌群α/β多样性及差异丰度（ANCOM-BC2）；FMT后检测角膜荧光素染色（corneal fluorescein staining, CFS）评分（NEI 0–15分）、体重校正泪液分泌量（酚红棉线法）及角膜/结膜/ LG组织中细胞因子与MUC5AC mRNA（qRT-PCR）；处死小鼠取LG、脾脏及外周血（peripheral blood, PB）分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），提取RNA进行BCR重链（IgH）高通量免疫测序，定义克隆型为相同IGHV/IGHJ基因对且互补决定区3（complementarity-determining region 3, CDR3）氨基酸序列一致的BCR序列，分析克隆型共享度与定型（stereotypic）克隆型比例；另从NOD-FMT组脾脏总RNA构建单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv）噬菌体展示文库，以Prevotella melaninogenica AQP衍生肽（PmE-L）及小鼠IgG为抗原进行生物淘选（biopanning）及ELISA筛选自身反应性克隆。

研究结果

3.1 FMT from an autoimmune dry eye mouse strain induces lacrimal gland inflammation and tear loss

FMT后NOD-FMT组角膜荧光素染色（CFS）评分较基线显著升高（p＝0.046，Wilcoxon检验），体重校正泪液分泌量显著降低（p＝0.024，配对t检验），而PBS-T组无此变化。qRT-PCR显示NOD-FMT组角膜结膜组织白细胞介素（IL）-6 mRNA水平升高、MUC5AC mRNA水平降低（分别p＝0.004和p＝0.0005，Mann-Whitney检验），提示组织炎症及黏蛋白合成受损，TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、TGF-β、EGF无组间差异。表明源自自身免疫干眼病模型的FMT可在B6受体中传递干眼病的临床病理特征。

3.2 FMT alters gut microbial composition.

FMT前两组α多样性（Shannon指数）与β多样性（Bray-Curtis相异度）无差异；FMT后β多样性组间显著分离（PERMANOVA p＝0.0004）。ANCOM-BC分析显示NOD-FMT组Uncultured_order_Rhodospirillales、Blautia、Alloprevotella、Parasutterella、Tannerellaceae、Desulfovibrio、Helicobacter、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、未分类Prevotellaceae、未分类Enterobacterales及Rikenella相对丰度显著升高。属水平分析确认Blautia、Escherichia-Shigella和Tannerellaceae上调，Anaerotruncus、Bacteroides、Clostridia_vadinBB60_group、Lachnospiraceae_NK4A136_group、未分类Lachnospiraceae、Muribaculaceae、未分类及未培养Oscillospiraceae、未培养Peptococcaceae下调（均p＜0.01）。表明FMT成功重塑受体肠道菌群并富集SjD相关失调菌属。

3.3 FMT shapes concordant BCR repertoires

LG中NOD-FMT组鉴定出12249个克隆型，PBS-T组22691个；脾脏中分别为1778376和925445个。组内两两小鼠BCR克隆型余弦相似度分析显示NOD-FMT组内相似度显著高于PBS-T组内及跨组比较（p＝0.001及p＜0.0001），说明FMT塑造了高度趋同的BCR库。进一步分析发现，NOD-FMT组LG中存在多个被多只小鼠共享的定型克隆型（如9/10小鼠共享1个，5/10共享3个等），而PBS-T组极少（仅3/9共享4个，2/9共享142个），差异极显著（p＜0.0001）；脾脏呈现相同趋势。表明FMT诱导LG及脾脏中出现高频共享的定型BCR克隆型，形成协同性体液免疫反应。

3.4 FMT drives preferential expansion of stereotypic BCR clonotypes

NOD-FMT组LG中187个定型BCR克隆型平均频率为4.78×10^–3，显著高于该组全部BCR克隆型均值8.05×10^–4（p＜0.0001），且随共享度升高频率增大；脾脏中定型克隆型平均频率（1.52×10^–5）也高于全部克隆型均值（4.69×10^–6，p＜0.0001）。说明FMT后定型BCR克隆型在LG及脾脏中均发生偏好性克隆扩增。

3.5 Stereotypic BCR clonotypes evolve locally and disseminate systemically

含胚系序列（体细胞高频突变somatic hypermutation, SHM＝0）的克隆型比例：NOD-FMT组LG定型克隆型中为84.0％，高于PBS-T组61％（p＜0.0001），提示LG定型克隆型含较多未经历SHM的胚系BCR序列，表明其在LG内局部新生/发育；脾脏定型克隆型中NOD-FMT组为99.5％，与PBS-T组相当。克隆型组织重叠分析显示，NOD-FMT组中65.8％的LG定型克隆型同时存在于同鼠脾脏（高于PBS-T组24.7％，p＜0.0001），而脾脏定型克隆型仅0.8％见于LG（与PBS-T组1.0％近似）；外周血（PB）池中28.3％的LG定型克隆型见于PB（高于PBS-T组18.5％，p＝0.050），高共享度（≥5/10）LG定型克隆型均同时出现于LG、脾脏及PB。表明FMT后定型BCR克隆型优先在LG局部产生并系统性播散。

3.6 NOD-FMT induces autoreactive BCR clonotypes targeting AQP-5 and IgG

以PmE-L（与AQP-5同源的Prevotella melaninogenica水通道蛋白衍生肽）和小鼠IgG进行scFv噬菌体展示文库淘选，筛选出PmE-L反应性克隆型P_2G10及P_3D2，以及小鼠IgG反应性克隆型G_1H4、G_1E3、G_1A9。其中P_2G10克隆型在NOD-FMT组LG及脾脏中平均频率较PBS-T组分别高出＞600倍及＞200倍，提示FMT诱导了靶向AQP-5同源肽及IgG（类风湿因子样）的自身反应性BCR克隆型偏好性扩增，符合失调菌群驱动的趋同自身免疫B细胞应答。

讨论与结论总结

既往报道SjD患者存在肠道失调，将SjD患者菌群移植至无菌小鼠可加重干眼表屏障破坏；本研究首次将NOD.B10.H2^b自发干眼模型小鼠肠道菌群FMT至免疫健全B6小鼠，发现其可诱导SjD样眼表炎症（CFS评分升高、泪液减少、IL-6上调、MUC5AC下调）及特征性菌群改变（Blautia、Escherichia-Shigella等富集）。尽管小鼠BCR库本应高度多样，FMT却使NOD-FMT组受体在LG和脾脏中出现大量高频共享的定型BCR克隆型且发生克隆扩增，其中LG定型克隆型富含胚系序列提示局部发育，且可播散至脾脏和外周血，部分克隆型识别AQP-5同源肽及IgG，符合微生物抗原驱动的选择性B细胞活化与自身反应性扩增。该模式与SjD患者唇唾液腺中寡克隆B细胞扩增及血中CD21^–/lowB细胞克隆扩展现象相似。研究局限性在于多数定型BCR克隆型所识别的自身抗原尚未确定，受限于LG浆细胞稀少及重链-轻链配对重建困难，未来需单细胞测序予以阐明；此外样本量较小属探索性研究，需更大样本验证。综上，研究人员得出结论：将自身免疫干眼病模型小鼠肠道菌群FMT至免疫健全B6小鼠可在受体中诱导SjD样临床病理特征、协调重塑肠道微生物组，并使定型BCR克隆型在泪腺局部产生、扩增并进入全身循环，揭示了肠-眼免疫轴中菌群移植诱导定型、可系统性播散BCR克隆型从而参与自身免疫干眼免疫发病机制的机制。