基于重组水疱性口炎病毒的伪病毒中和试验用于定量检测抗拉沙病毒中和抗体的开发与验证

《Frontiers in Immunology》：Development and validation of a pseudotyped virus neutralization assay for quantification of anti-Lassa virus neutralizing antibodies

　　

拉沙病毒（Lassa virus, LASV）在多个西非国家呈地方性流行，具有重要的流行/大流行潜力。流行病应急准备创新联盟（Coalition for Epidemic Preparedness Innovations, CEPI） centralized laboratory network（CLN）正在开发经过验证的协调方法，以在暴发疫情时支持和加速疫苗开发。研究人员在此展示了一种用于定量检测抗拉沙病毒中和抗体的试验方法的开发与验证。由于该方法使用伪病毒（pseudotyped virus, PV）而非真实的拉沙病毒——一种被列为危险等级4级的病原体——因此可以在较低的生物安全防护水平下进行，使其广泛可及，尤其是在拉沙热流行的地区。

研究人员开发了一种基于重组水疱性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV）的伪病毒中和试验（pseudotyped virus neutralization assay, PVNA）。制备了工作标准品（working standard, WS），并将其与拉沙病毒中和抗体国际标准品（International Standard, IS）进行校准，使结果能够以国际单位（International Units, IU）表示。该方法依据国际人用药品注册技术协调会（International Council for Harmonisation, ICH）Q2(R2)指南进行验证。

基于rVSV的PVNA成功开发并验证。该试验的分析范围为10–100 IU/mL，来自拉沙疫苗临床试验的血清阳性样本均在此范围内。PVNA的结果与真实病毒中和方法获得的结果呈直接相关性。因此，该方法被认为适用于预期目的。

研究人员成功开发并验证了一种用于定量检测抗拉沙病毒中和抗体的PVNA。研究人员还提供了一个如何将血清学方法校准至WHO国际标准品的实际案例，以实现研究间更高的协调性和可比性。该方法目前正在CLN的合作伙伴实验室间进行技术转移，以实现临床试验样本的协调检测，并支持拉沙疫苗候选物的开发与评估。

拉沙病毒（Lassa virus, LASV）是一种沙粒病毒科（Arenaviridae）成员，为拉沙热（Lassa fever）的致病因子，被世界卫生组织（World Health Organization, WHO）研发蓝图（R&D Blueprint）和流行病应急准备创新联盟（Coalient for Epidemic Preparedness Innovations, CEPI）列为优先病原体，原因在于其显著的流行潜力以及目前尚缺乏获批疫苗。尽管已有多个疫苗候选物处于临床前和Ⅰ期研究阶段，甚至有一个候选物于2024年4月推进至Ⅱ期临床试验，但拉沙热的防控仍面临严峻挑战。拉沙热在西非和中非多个国家呈地方性流行，可引起严重甚至致命的症状。由于LASV被列为危险等级4级（hazard group 4）病原体，必须在高度 containment facility 中操作，这极大地复杂化了疫苗开发工作，特别是对于疫苗诱导免疫应答保护效力的评估。中和抗体（neutralizing antibodies）在疫苗开发和评价过程中常被用作保护作用的替代指标（surrogate/correlate of protection），然而真实LASV的中和试验因严格的操作限制、有限的设施可及性、高昂成本以及低通量等问题而严重受限。对于后期临床试验而言，通常需要检测数千份样本，这在生物安全四级（Containment Level 4, CL-4）环境中是不切实际的。

为解决上述瓶颈，研究人员开发了基于重组水疱性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV）的伪病毒中和试验（pseudotyped virus neutralization assay, PVNA）。伪病毒（pseudotyped virus, PV）技术通过将目标病毒的包膜蛋白展示于无关病毒载体表面，同时去除或修饰载体病毒自身的包膜蛋白基因并掺入报告基因（如荧光素酶），使伪病毒具有与真实病毒相似的受体嗜性，但无致病性且可在生物安全二级（CL-2）条件下安全操作。CEPI建立的集中化实验室网络（Centralized Laboratory Network, CLN）目前包含20个合作伙伴，其核心目标是开发、验证并实现协调定量的疫苗免疫原性评估方法，包括结合抗体检测[酶联免疫吸附试验（ELISA)、Luminex、Meso Scale Discovery (MSD)]、中和抗体检测[病毒中和试验（Virus Neutralization Assay, VNA)及PVNA]以及细胞免疫检测[酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot, ELISPOT)]，从而消除不同临床试验因方法学、读数方式及实验室能力差异带来的混杂因素，实现不同地域和时期研究结果的可比性。

本研究的技术方法主要包括以下几个方面。在样本来源方面，研究使用了由英国药品和医疗保健产品监管机构（Medicines and Healthcare products Regulatory Agency, MHRA）代表WHO生产分发的人WHO抗拉沙热病毒抗体国际标准品（NIBSC编码20/202）和国际参考品组（NIBSC编码21/332），以及来自塞拉利昂拉沙热康复者血浆的7份额外血清阳性样本用于工作标准品可行性研究；此外还使用了来自美国、英国健康献血者的血清阴性血浆，以及由国际艾滋病疫苗倡议组织（International AIDS Vaccine Initiative）提供的临床试验志愿者血清池。在核心实验技术方面，研究采用基于rVSV的伪病毒系统，通过将水疱性口炎病毒糖蛋白基因替换为萤火虫荧光素酶报告基因的重组VSV载体，在表达LASV Josiah株（Lineage IV）糖蛋白的HEK293T/17细胞中制备携带LASV包膜的伪病毒颗粒；利用Vero细胞进行病毒滴度测定（以50%组织培养感染剂量，TCID₅₀，通过Spearman-Karber法计算）和后续中和试验；中和试验采用96孔板格式，将抗体样本进行二倍系列稀释后与伪病毒共孵育，再接种至Vero细胞，24小时后通过BrightGlo荧光素酶底物检测相对光单位（relative light units, RLU）以评估感染性；数据分析采用SoftMaxPro GxP v7.1软件，基于四参数逻辑回归曲线拟合计算50%中和滴度（NT₅₀），并将结果以IU/mL表示；方法验证严格遵循ICH Q2(R2)指南，涵盖准确度、稀释线性、特异性、灵敏度、选择性、重复性、中间精密度、分析范围及检测限等性能特征；此外还通过Pearson相关分析和Bland-Altman分析对PVNA与真实病毒中和试验结果进行相关性评价。

研究结果部分，各小节内容及结论如下。

LASV rVSV伪病毒的产生、稳定性及其在PVNA中的应用。通过感染表达LASV Josiah系糖蛋白的HEK293T细胞，制备了基于VSV的LASV伪病毒颗粒，病毒滴度为1.12 × 10⁷ TCID₅₀/mL。稳定性评估显示，-80°C储存2年无滴度损失，-20°C储存1年损失1–2 log₁₀ TCID₅₀，而4°C或室温储存降解更快。该PVNA采用96孔板格式，每板可同时检测最多4份样本，每板包含作为校准品的工作标准品（WS）及用于监测试验有效性的低浓度阳性对照（low positive control, LPC）。

工作标准品针对WHO抗拉沙病毒抗体国际标准品的校准。按照WHO指南，将Lassa热恢复期血浆制备的工作标准品与国际标准品20/202进行平行线分析（parallel line analysis），6次独立试验的几何均值为31.8 IU/mL（95%置信区间：27.6–36.6 IU/mL）。将WS纳入每板检测并使结果相对于WS报告，对于以IU表达样品效价、实现不同运行批次、实验室和方法间的比较至关重要。

PVNA准确度和稀释线性。使用国际标准品20/202添加至阴性人血浆制备的5–100 IU/mL浓度梯度样品板，经3次独立运行评估。5 IU/mL样品均无法检出，10–100 IU/mL范围内所有加标回收样品均落在50%–200%的可接受限内；回归斜率为1.026（可接受标准0.80–1.20），R²为0.9695，残差分布均匀。方法在10–100 IU/mL范围内准确且线性良好。

PVNA灵敏度、特异性和选择性。使用15份阳性及13份阴性样品评估，基于此前支持国际标准品建立的合作研究结果确定真阳性，PVNA结果与之一致，灵敏度与特异性均达100%（虽置信区间因样本量有限而较宽）。选择性通过将LASV阳性样品分别添加至Ig耗竭人血清或立夫特谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）阳性血清中评估，两者获得相似滴度，GCV为15.2%，表明无明显干扰。

PVNA精密度。重复性通过3份不同滴度样品在单块板内三次重复测定评估，混合效应方差分析显示总体GCV为12.12%（可接受标准≤50%）。中间精密度通过4份样品由2名操作者在3天内分别检测评估，操作者贡献可忽略，主要变异来源为日间变异和误差（生物学变异），总体GCV为28.28%（可接受标准≤50%）。

PVNA分析范围和检测限。通过准确度、线性和中间精密度数据重新评估精密度，除5 IU/mL不可检测外，其余加标回收稀释度的GCV均≤30%，确定分析范围为10–100 IU/mL。检测限（limit of detection, LOD）定义为最低可产生阳性信号的浓度，需满足NT₅₀ > 20（基于初始1:20稀释）、R² ≥ 0.750及至少一个稀释度产生>50%中和三个标准；最低真阳性样品滴度为8.60 IU/mL，满足LOD ≤ 20 IU/mL的标准。

临床试样评价。对来自候选拉沙疫苗临床试验的3份样品池进行检测：高滴度和中滴度样品分别为57.76 IU/mL和42.74 IU/mL，落在方法建立范围内；低滴度样品低于LOD，但中和曲线显示存在低水平中和活性。结果提示所建立的方法范围适用于临床试验样品检测，但需更多样本验证。

PVNA与真实病毒中和试验结果的比较。使用PVNA检测此前在国际标准品20/202建立合作研究期间经真实病毒中和试验检测的7份样品子集。PVNA结果与真实病毒中和活性结果相关良好（Pearson r = 0.974，p = 0.001；Spearman rho = 0.964，p < 0.001）；Bland-Altman分析显示PVNA效价平均略高于真实病毒中和试验，但一致性界限跨零点。

稳健性。对3份阳性样品及低阳性对照进行关键条件故意变动评估，包括细胞传代次数（P+2至P+20）、细胞接种密度（3–7 × 10⁵/mL）、室温孵育时间（60–90 min）、中和时间（45–75 min）及感染持续时间（22–26 h）；另对2份额外样品进行5或10次冻融循环处理。虽然个别样品效价有波动，但无持续偏高或偏低的趋势。

讨论部分，研究人员指出，在暴发情境下，验证且协调的方法可大幅加速候选疫苗的开发与评价。本研究开发的PVNA可在CL-2条件下进行，全程约28–30 h，操作人员时间约3–4 h。通过将工作标准品校准至WHO国际标准品，使不同实验室和时期的结果得以比较，促进不同候选疫苗的对比评估，并有助于监管机构审批。研究人员鼓励遵循本研究描述的校准方法以符合WHO指南。对于灵敏度与特异性的估计，由于难以获得大量Lassa阳性样本，虽估计值均为100%，但下限置信区间低于80%，预计约需各50份阳性和阴性样本方可获得下限90%的置信区间；随着CEPI CLN内疫苗评价的推进，这些估计可进一步精修。

分析方法范围的确定为10–100 IU/mL。现有研究样本多来自恢复期患者，而方法主要预期用途为定量免疫接种诱导的中和抗体应答。对有限数量临床试验参与者样本的初步评估显示，观察滴度落在方法分析范围内，但需更多代表性样本确认。若显著比例样本超出定量上限，将开展桥接试验验证扩展范围，或确认高于上限样本的预稀释不损害准确度与精密度。

与真实病毒中和试验的比较显示两者总体一致性良好，PVNA结果略高，这一偏向在多种病毒的伪病毒系统中已有观察。确切机制尚未明确，可能包括伪病毒试验在单次感染周期后读数而真实病毒试验通常在多轮病毒复制后读数，后者可能需要更高浓度抗体以中和持续复制；伪病毒与真实病毒间糖蛋白密度差异也可能影响中和所需抗体水平。需强调的是，本研究可比较的样本有限（n = 7），扩大样本量的分析将有助于确认和扩展上述发现。初步稳健性评估显示，在操作者、设备、环境条件等实验室间差异预期范围内变动时，未观察到样品效价的一致性差异；方法重现性目前正通过正式分析方法转移进行评估，新的关键试剂批次将通过正式桥接研究确认适用性。

研究结论为：研究人员已成功开发并验证了一种用于定量检测抗拉沙病毒中和抗体的PVNA。研究人员还提供了一个如何将血清学方法校准至WHO国际标准品以实现研究间更高协调性和可比性的实际案例。该方法目前正在CLN合作伙伴实验室间进行技术转移，以增加拉沙疫苗临床试验样本检测的能力和韧性。工作标准品对WHO国际标准品的纳入使结果能够以IU/mL表示，从而实现不同检测地点结果的简单比较，以及不同临床试验结果的关键性比较。研究间可比性的提高有助于做出知情决策并支持监管审批；协调化也有助于保护性相关因素/替代指标的识别，从而为患者管理和公共卫生指南提供信息。