少炎镇痛方(Soyeom-Jetong Mixture)减轻NLRP3炎症小体(NLRP3 Inflammasome)介导的炎症反应

《Frontiers in Pharmacology》：Soyeom-Jetong mixture attenuates NLRP3 inflammasome-mediated inflammation

　　

背景：少炎镇痛方(Soyeom-Jetong, SJ)是由白芍(Paeonia lactiflora) Pallas、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata) Batal及延胡索(Corydalis yanhusuo) W.T. Wang组成的传统东亚复方，传统用于治疗炎性疾病。鉴于NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)在炎症相关病理中的核心作用，SJ作为潜在抗炎调节剂备受关注，但其抗炎分子机制尚不清楚。本研究旨在评估SJ在脂多糖(LPS)诱导的斑马鱼模型中的抗炎功效，并明确其对NLRP3炎症小体体外(in vitro)的调控作用。方法：通过LPS暴露及尾部截断法建立斑马鱼胚胎炎症模型，采用苏丹黑B(Sudan Black B)染色及全胚原位杂交(whole-mount in situ hybridization, WISH)检测中性粒细胞浸润评估SJ抗炎效应；体外(in vitro)实验考察SJ对NLRP3炎症小体活化的调控作用。结果：SJ显著减少LPS暴露斑马鱼尾造血组织(caudal hematopoietic tissue, CHT)及截尾损伤部位的中性粒细胞聚集，调节NLRP3及促炎细胞因子等炎症基因表达；体外(in vitro)实验中SJ抑制NLRP3炎症小体活化。结论：SJ通过调节中性粒细胞炎症及抑制NLRP3炎症小体体外(in vitro)活化发挥抗炎活性，上述发现为SJ的药理活性提供了实验依据，提示其作为抗炎候选物值得进一步研究。

论文解读：少炎镇痛方(Soyeom-Jetong Mixture)减轻NLRP3炎症小体(NLRP3 Inflammasome)介导的炎症反应

本文发表于《Frontiers in Pharmacology》。炎症是机体防御感染和组织损伤的基础机制，但失调或慢性炎症可导致组织损伤及相关疾病。NLRP3炎症小体是多蛋白复合物，通过激活白细胞介素(interleukin, IL)-1β放大炎症反应，其活化分启动(priming，核因子κB即NF-κB信号诱导NLRP3及pro-IL-1β表达)和激活(activation，包括活性氧reactive oxygen species, ROS生成、内质网应激、K⁺外流等触发复合物组装)两步，是多种炎症性疾病的关键治疗靶点。目前尚无FDA批准的NLRP3抑制剂上市。少炎镇痛方(Soyeom-Jetong, SJ)由白芍(Paeonia lactiflora)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata)及延胡索(Corydalis yanhusuo)组成，单味药成分如芍药苷(paeoniflorin)、甘草酸(glycyrrhizic acid)及延胡索生物碱已有抗炎报道，但复方协同抑制NLRP3炎症小体的实验验证有限。因此研究人员采用体内(in vivo)斑马鱼炎症模型及体外(in vitro)细胞实验，探讨SJ的抗炎作用并明确其对NLRP3炎症小体通路的调控机制。

主要关键技术方法：

研究人员将白芍、胀果甘草、延胡索按1:1:1比例经70%乙醇双次回流提取、过滤、分级醇沉、除菌过滤及冷冻干燥制备SJ冻干粉，并用超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)定量甘草酸、白芍总苷(albiflorin)及芍药苷为质控标志物。以野生型AB系斑马鱼(Danio rerio)胚胎为对象，LPS浸泡诱导炎症或3天_post-fertilization(dpf)胚胎尾鳍截断制造物理损伤，苏丹黑B染色及全胚原位杂交(WISH)检测尾造血组织(caudal hematopoietic tissue, CHT)及损伤区中性粒细胞(neutrophil)与巨噬细胞(macrophage)标记基因mpx、mfap4表达；实时荧光定量PCR(qPCR)检测IL-1β、IL-6及NLRP3 mRNA水平。体外采用小鼠巨噬细胞J774A.1及佛波酯(PMA)分化的THP-1人单核细胞，LPS启动(priming)后给予尼日利亚菌素(nigericin)或ATP激活NLRP3炎症小体，SJ预处理后检测细胞活力、上清及胞内IL-1β分泌（Western blot）、NF-κB荧光素酶报告基因活性、线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP, JC-1探针)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)寡聚化(二琥珀酰亚胺辛二酸酯disuccinimidyl suberate, DSS交联)。另以dsDNA激活AIM2炎症小体、鞭毛蛋白(flagellin)激活NLRC4炎症小体验证选择性。

研究结果

UPLC-based identification and quantification of marker compounds in SJ：研究人员通过UPLC比对对照品保留时间及紫外光谱，确认SJ中含甘草酸(29.18 mg/g)、albiflorin(53.01 mg/g)及芍药苷(66.05 mg/g)，证明制剂质量可控、批次一致。

Dose-dependent effects of SJ on zebrafish survival and developmental phenotypes：研究人员将1 dpf斑马鱼胚胎暴露于0–10 mg/mL SJ至5 dpf，发现≥5 mg/mL SJ致死亡及心包水肿(edema)，≤0.1 mg/mL SJ无显著形态学异常及毒性，确定后续药效实验选用无毒浓度范围(0.001–0.1 mg/mL)。

SJ reduces neutrophil accumulation in LPS-induced zebrafish inflammation models：研究人员在LPS诱导炎症及尾鳍截断模型中观察到，0.01及0.1 mg/mL SJ显著降低CHT区及损伤部位苏丹黑B阳性中性粒细胞数目；WISH显示中性粒细胞标记mpx及巨噬细胞标记mfap4表达下调。qPCR显示LPS上调的NLRP3 mRNA被SJ抑制(P<0.05)，IL-1β及IL-6呈下降趋势但未达统计学显著。表明SJ在体内抑制中性粒细胞及巨噬细胞招募，并下调NLRP3表达。

SJ suppresses NLRP3 inflammasome activation in vitro：研究人员证实≤10 mg/mL SJ对J774A.1及PMA分化THP-1细胞无显著细胞毒性。LPS启动后给予SJ再经ATP或nigericin激活NLRP3，SJ剂量依赖性地抑制培养上清中成熟IL-1β分泌，但不影响胞内pro-IL-1β及α-tubulin表达。SJ对dsDNA激活的AIM2炎症小体及鞭毛蛋白激活的NLRC4炎症小体介导IL-1β分泌无抑制作用，提示SJ选择性作用于NLRP3炎症小体而非泛炎症小体抑制。

SJ suppresses ASC oligomerization without affecting NF-κB activation or mitochondrial ROS levels：研究人员通过NF-κB荧光素酶报告实验发现TNF-α显著激活NF-κB，但各浓度SJ对此无显著抑制，说明SJ不影响NLRP3启动(priming)阶段。JC-1染色显示SJ不改变ATP诱导的线粒体膜电位去极化(即不影响线粒体ROS水平)。ASC寡聚化(DSS交联-Western blot)检测发现SJ显著抑制NLRP3活化后ASC斑点蛋白(ASC)寡聚体形成，表明SJ作用于NLRP3炎症小体组装阶段，通过抑制ASC寡聚化阻断炎症小体复合体形成及下游caspase-1活化与IL-1β成熟释放。

讨论与结论：

研究人员指出，SJ复方中白芍(含paeoniflorin)、胀果甘草(含glycyrrhizic acid)及延胡索(含生物碱)可能通过多成分协同发挥抗炎效应，本研究表明其在无毒浓度下可减轻斑马鱼LPS及损伤诱导的中性粒细胞炎症，并在体外选择性抑制NLRP3炎症小体活化——不影响上游NF-κB信号及线粒体ROS，而是抑制ASC寡聚化从而阻断炎症小体组装。SJ效果与经典NLRP3特异性抑制剂MCC950相当，且对AIM2及NLRC4无影响，具NLRP3亚型选择性。由于SJ为多成分配方，具体活性单体及确切结合靶点尚需进一步植物化学分离鉴定及哺乳动物体内实验验证。研究结论为：少炎镇痛方(Soyeom-Jetong, SJ)在实验条件下通过调节中性粒细胞炎症及抑制NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)活化(in vitro)发挥抗炎作用；这些结果为SJ的药理活性提供了实验支持，提示其可作为抗炎候选物进行进一步研究。