《Frontiers in Pharmacology》：Filling the mechanistic and methodological gaps for predicting cytokine release syndrome in humans
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细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）是一种与CAR-T细胞及双特异性T细胞衔接器（Bispecific T-cell Engagers, BiTEs）等免疫治疗相关的严重免疫介导毒性。由于现有动物模型和体外（in
细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）是一种与CAR-T细胞及双特异性T细胞衔接器（Bispecific T-cell Engagers, BiTEs）等免疫治疗相关的严重免疫介导毒性。由于现有动物模型和体外（in vitro）系统无法充分模拟病理性炎症的复杂性、全身性及各患者特异性，预测人CRS仍十分困难。本述评强调了当前免疫毒理学方法的关键机制与方法学局限，并提出适用于生物治疗药物的免疫相关不良结局通路（immune-related Adverse Outcome Pathway, irAOP）框架。irAOP方法将CRS构建为一系列相互关联的关键事件（Key Events, KEs），包括免疫细胞活化、促炎细胞募集及过量细胞因子释放，这些KEs经现有AOPs协调统一以区分病理性炎症与正常免疫反应，并强调对内皮细胞活化和血管渗漏等CRS严重程度核心下游事件的关注。发热、低血压、缺氧、水肿及多器官功能障碍等临床表现被关联至晚期KEs，从而在分子事件与患者结局间建立机制桥梁。借鉴COVID-19相关irAOP开发及imSAVAR联盟等国际倡议，本文提出改进CRS预测的路线图：明确使用情境（Context of Use, CoU）、通过定量关键事件关系（Key Event Relationships, KERs）强化机制证据、推进人源相关新型替代方法（New Approach Methodologies, NAMs）。在irAOP框架内整合先进的in vitro及离体（ex vivo）系统，可将碎片化数据转化为具决策相关性的连贯工具，推动向预测性、以人为中心的免疫治疗CRS风险评估与管理转变。
本文对发表于《Frontiers in Pharmacology》的述评文章"Filling the mechanistic and methodological gaps for predicting cytokine release syndrome in humans"进行解读。该研究针对CAR-T细胞及双特异性T细胞衔接器等免疫治疗引发的细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）难以通过传统临床前模型预测人源反应的问题，研究人员提出采用免疫相关不良结局通路（immune-related Adverse Outcome Pathway, irAOP）框架整合人源新型替代方法（New Approach Methodologies, NAMs），系统梳理了CRS从分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE）、核心炎症枢纽关键事件（Key Events, KEs）到晚期临床表型相关KEs及不良结局（Adverse Outcome, AO）的因果链条，指出当前定量关键事件关系（Key Event Relationships, KERs）缺失、个体异质性因素未充分纳入及NAMs监管认可不足等挑战，最终给出将NAMs映射至irAOP各KEs并经由整合测试与评估方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA）及下一代风险评估（Next-Generation Risk Assessment, NGRA）推进CRS预测与监管应用的具体路径，为细胞免疫治疗的机制性安全评价提供统一 scaffold。
研究人员开展此项研究用到的主要关键技术方法为：基于已有AOP-Wiki中炎症相关枢纽KEs（如KE1492"Activation, Resident Immune Cells"、KE1496"Increase, Pro-inflammatory Mediators"、KE1497"Increase, Recruitment of Pro-inflammatory Immune Cells"及KE2068"Increase, Endothelial Dysfunction"、KE2067"Altered, Nitric Oxide Levels"、KE937"Impaired, Vasodilation"等）进行CRS特异性irAOP框架构建与适配；采用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）细胞因子释放测定（Cytokine Release Assay, CRA）检测早期免疫细胞活化及细胞因子（IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、GM-CSF）释放；结合器官特异性人源内皮细胞单层、血管化器官芯片（Organ-on-Chip）、三维共培养及离体（ex vivo）组织切片等人源NAMs评估血管内皮屏障功能（跨内皮电阻Transendothelial Electrical Resistance, TEER、葡聚糖通透性、VE-钙粘蛋白 disruption、ICAM-1/VCAM-1表达）及一氧化氮（Nitric Oxide, NO）/前列腺素E2（Prostaglandin E2, PGE2）/环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）水平；并借助体外-体内外推（in vitro–to–in vivo Extrapolation, IVIVE）、生理药代动力学（Physiologically Based Pharmacokinetic, PBPK）及定量系统毒理学（Quantitative Systems Toxicology, QST）模型尝试建立半定量/定量KERs，同时引入已知CRS诱导参照应激物（如OKT3单抗、阳性对照细胞因子）进行基准标定。
1 Introduction
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1.1 Regulatory challenges in prediction of immune-related adverse events induced by cellular immunotherapies：研究人员指出免疫调节疗法常引发免疫相关不良事件（immune-related Adverse Events, irAEs），CRS即为典型，临床表现为高热、低血压、低氧血症乃至多器官功能障碍。传统动物模型（如NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ即NSG小鼠）因种属差异及免疫缺陷无法重现CRS所需完整下游免疫互作（全身细胞因子放大、血管功能障碍、多器官受累），现行基于人PBMCs的细胞因子释放测定虽可反映T细胞活化潜能，但无法捕捉患者个体因素、肿瘤负荷及全身病理表现，且测得的细胞因子水平与临床CRS严重程度相关性差，受实验条件影响大，存在明显机制与方法学缺口。此外CAR-T相关免疫效应细胞相关神经毒性综合征（Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS）亦面临类似模型匮乏问题，提示需发展含脑类器官或血脑屏障模型的扩展irAOP。
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1.2 A mechanistic framework and human-relevant NAMs for predicting CRS：研究人员阐述不良结局通路（Adverse Outcome Pathway, AOP）概念——从分子起始事件（MIE）经系列KEs至AO，炎症相关KEs可作为跨AOP"枢纽"KEs。COVID-19期间建立的SARS-CoV-2诱发CRS之irAOP及imSAVAR联盟工作为生物药irAOP提供基础。本述评旨在说明如何将CRS-irAOP操作化为转化安全性评估工具，涵盖CoU定义、NAMs与MIE/KEs映射、定量/半定量KER开发、临床相关调节因子考量及IATA/NGRA整合，而非重复既有CRS AOP网络模型。
2 Proposed irAOP leading to CRS induced by cellular immunotherapies
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2.1 Molecular initiating events (MIE) for cellular immunotherapies：研究人员认为生物治疗性MIE不同于化学物，CAR-T细胞或T细胞衔接器直接活化免疫细胞，CAR-T具体内扩增、分泌细胞因子及多细胞类型交互特性，首条KE常为CAR-T或内源性T细胞自身活化（KEx: activation of immune cells）并释放促炎介质进而募集其他免疫细胞，故MIE与初始KE需依生物制剂特异性调整以区分有益与有害炎症及界定可接受免疫活化窗。
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2.2 Hub inflammatory KEs as central drivers of CRS：研究人员采用AOP-Wiki中KE1492（免疫细胞活化）、KE1497（促炎免疫细胞募集增加）及KE1496（促炎介质增加）作为CRS-irAOP核心炎症枢纽KEs，故意定义为较宽泛生物学层级以避免过度细分掩盖累积扰动至AO的阈值判定，并说明局部vs全身炎症是暴露情境及应激物分布依赖的KE表达方式差异而非固定先后步骤。
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2.3 Systemic cytokine release as a central immune amplification step in CRS：研究人员强调CRS本质为过量细胞因子驱动的全身炎症，KE1496与KE1497形成双向正反馈环路放大全身炎症反应，系统性生物制剂静脉给药可无明确局部起始期而直接引发全身免疫活化。
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2.4 Defining CRS as a set of adverse outcomes (AO)：研究人员主张CRS不应定义为单一AO而应通过须共同满足的一组晚期KEs（下丘脑PGE2产生/发热轴、血管内皮功能障碍致血管渗漏、全身低血压、低氧血症）来捕获临床综合征，多器官功能障碍主要源于细胞因子驱动的内皮活化致广泛血管渗漏及器官灌注不足而非实质直接损伤；并列表说明各临床症状对应晚期KE/生物学过程、靶器官、NAM检测终点（TEER、葡聚糖渗漏、VE-cadherin破坏、ICAM-1/VCAM-1、PGE2、COX-2、NO/亚硝酸盐、eNOS/iNOS）及转化局限。
3 Remaining challenges in developing an irAOP for CRS
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3.1 Tackling tissue specificity within broad KEs：研究人员指出AOP复用性原则与特定CoU要求组织/器官精确定义KE间存在张力，CRS-irAOP需补充器官特异性内皮屏障性质差异（肺、肠等）及完善AOP-Wiki条目以实现FAIR（Findable, Accessible, Interoperable, Reusable）原则。
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3.2 KERs and quantitative relationships–the key but missing pieces：研究人员阐明化学品管理基于预防原则而药品安全基于获益-风险评价，监管决策需剂量-反应关系即KER定量/半定量信息（阈值、时间点、转折态），目前CRS-irAOP缺乏上游免疫活化至下游血管渗漏等的响应-响应关系及IVIVE校准，建议结合PBPK/QST建模并利用上市后药物警戒数据迭代优化irAOP。
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3.3 Modulating factors participating in the heterogeneity of the outcome：研究人员综述影响免疫应答的宿主因素（年龄、性别、遗传、合并症、肠道菌群、饮食ω-6/ω-3比例、维生素D水平等），但特别指出CAR-T相关CRS中肿瘤负荷（target burden）为最主要决定因素，高龄及性别未显示与CRS严重度一致相关，不同于COVID-19背景，强调CAR-T情境下疾病与治疗参数比单纯宿主固有特征更关键。
4 From irAOP to NAM-based next-generation immunotoxicity testing：研究人员说明下一代风险评估（NGRA）与整合测试与评估方法（IATA）概念，指出现行人源NAMs（器官芯片、3D共培养、离体切片）呈碎片化，嵌入irAOP后可按KEs映射各NAM读值（早期KE可用已获部分监管认可的PBMC-CRA测IL-6等细胞因子及CD69/CD25活化标志；中期KE用细胞因子刺激单核/巨噬细胞测PGE2/COX-2；晚期KE用器官特异性内皮单层或微生理系统测TEER、渗透率、VE-cadherin、NO等；血小板-中性粒细胞互作用测血栓炎症），并以典型CRS诱导参照应激物（如OKT3、阳性T细胞衔接器或CAR-T产品）做基准质控。建议在可行时纳入患者来源细胞及疾病相关靶细胞负荷以反映异质性，综合多互补NAMs进行证据权重（Weight-of-Evidence）解读而非孤立端点判断。
5 Computational challenges and opportunities in irAOP induced by biotherapeutics：研究人员论述AOP可用机器可读格式编码并结合组学数据，irAOP指导的QST模型及lab-in-the-loop或model-in-the-loop范式（含机器学习/人工智能辅助假设生成）可实现"领域知识→计算模型→湿实验验证→模型修正"循环。现存挑战含缺乏标准机器可读AOP构建协议、AOP持续维护需专家资源、患者数据隐私与质量及免疫系统高度动态致AOP快速过时需频繁更新。
6 Towards regulatory acceptance of NAMs for cellular immunotherapies：研究人员引欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）对NAMs要求——明确定义方法、科学有效性（可靠性与相关性）、优于或等同现有方法预测值，并指出生物医药领域用"资格认定"（qualification）区别于化学品NAMs"验证"（validation）。监管接受需：①早期持续沟通明确fit-for-purpose CoU（化合物去风险、剂量选择或首次人体试验决策支持）；②具(半)定量KERs的人源相关机制证据含阈值与临床变异性；③标准化方案、室间/室内重现性及参照应激物基准；④IATA框架下证据权重整合并透明说明适用范围与局限。强调单体NAM不足以预测CRS，须在irAOP内整合多互补NAMs并由IVIVE/PBPK/QST关联临床暴露情境。
7 Conclusion & outlook（讨论与结论翻译总结）：研究人员总结现行动物模型与还原论in vitro检测不足以捕捉生物治疗诱导过度免疫活化的复杂全身及患者特异性本质。所提CRS-irAOP框架以共享炎症枢纽KEs连通过量细胞因子释放至内皮功能障碍、血管渗漏、低血压、低氧及多器官功能障碍等晚期KEs，将CRS解构为多晚期KE汇聚之复合临床综合征，匹配临床现实与机制解析。将人源NAMs嵌入irAOP使孤立实验转为决策相关工具，支持证据权重策略与不确定度透明传达。未来需：①建立定量/半定量KERs（含阈值、转折态、时序）辅以PBPK/IVIVE；②早期与监管机构互动明确CoU，利用上市后数据建学习循环；③整合肿瘤负荷、免疫史等疾病参数至NAMs以捕获取个体异质性。irAOP、NAMs与IATA融合有望超越描述性动物实验，建立预测性、机制为本之免疫毒理评价新范式，提升CRS风险预测力、加速创新并保障患者安全。
