《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Advances in mycobacteriophage research: from lytic mechanisms to one health applications
分枝杆菌噬菌体是专一性感染分枝杆菌宿主的病毒。由于其能够穿透分枝杆菌独特而复杂的细胞壁屏障，分枝杆菌噬菌体近年来已成为诊断和治疗耐药性分枝杆菌感染的有前景工具。本文系统综述了分枝杆菌噬菌体的分类、基因组特征、裂解与溶原机制，以及噬菌体与宿主之间复杂的防御—反防御策略。此外，研究人员从同一健康（One Health）视角探讨了分枝杆菌噬菌体在人类健康、动物健康和环境管理中的多样化应用，包括快速检测、耐药感染治疗、环境监测和职业暴露管理。总体而言，分枝杆菌噬菌体在对抗耐药性感染方面具有重要前景，并将在综合性同一健康策略中发挥重要作用。
1 Mycobacteriophages
分枝杆菌是一类具有复杂细胞壁结构的细菌，其细胞壁富含分枝菌酸、糖脂和糖肽脂，因而表现出对多种抗生素的固有耐受性以及抗酸染色特性。该属主要包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌又可分为快速生长分枝杆菌与缓慢生长分枝杆菌。分枝杆菌噬菌体是专一性感染分枝杆菌属的双链DNA（dsDNA）尾噬菌体，归属于尾噬菌体纲（Caudoviricetes）。其能够穿透分枝杆菌异常厚重且疏水的蜡样细胞壁并建立有效感染，这一特征构成了其在致病性分枝杆菌感染诊断和治疗中应用的基础。随着高通量测序与系统生物信息学的发展，分枝杆菌噬菌体的识别与注释数量持续增加，展现出极高的基因组多样性，并为解析噬菌体—宿主相互作用机制以及开发抗分枝杆菌新策略提供了丰富资源。
1.1 Morphology and classification
现有研究表明，大多数分枝杆菌噬菌体以耻垢分枝杆菌 `mc
2155` 作为主要分离和扩增宿主。已发现的分枝杆菌噬菌体均具有双链DNA（dsDNA）基因组，并属于尾噬菌体纲（Caudoviricetes）。依据尾部结构差异，可进一步划分为具收缩尾、长非收缩尾和短尾三类形态群，其中长非收缩尾类型占绝大多数。部分噬菌体呈现典型“蝌蚪状”外形，不同亚簇在头尾比例上存在差异，而短尾噬菌体在该类群中则较为罕见。在衣壳结构方面，多数分枝杆菌噬菌体具有直径约40~80 nm的等轴二十面体头部，少数噬菌体则呈长形或纺锤样头部。
除形态差异外，分枝杆菌噬菌体在基因组层面表现出显著遗传异质性，呈现由不同祖先来源功能模块拼接形成的镶嵌式进化特征。相关研究普遍采用基于序列相似性和系统发育聚类的“簇—亚簇—单例”三级分类框架。该分层分类体系揭示了分枝杆菌噬菌体在进化分化上的广泛性，也提示其感染策略、生活史模式与宿主适应机制存在显著差异。
1.2 Genomic characteristics and conserved gene-encoded proteins
分枝杆菌噬菌体基因组均由双链DNA（dsDNA）构成，可呈线性或环状装配形式，但部分看似环状的基因组经限制性内切酶作图后被证实本质上仍为线性结构。其基因组大小差异较大，从 `38,120 bp` 到 `164,602 bp` 不等，多数集中在 `40–60 kb` 区间。典型基因组通常包含 `58–88` 个编码序列，基因密度较高，显示出明显的紧凑性。其GC含量与宿主分枝杆菌相近，提示双方在长期共存过程中发生了深度协同进化。
这类噬菌体基因组具有高度模块化特征，必需功能基因多按功能分区排列，非结构基因则常集中于基因组右臂。结构基因主要编码衣壳、尾部及相关组装蛋白，参与病毒粒子的精确装配、宿主识别和感染建立。保守的头部相关蛋白包括主要衣壳蛋白、脚手架蛋白和门户蛋白；尾部相关保守蛋白则包括主要尾蛋白、次要尾蛋白、卷尺蛋白（TMP）和尾纤维相关蛋白。其中，卷尺蛋白往往是基因组中最长的保守基因，其长度与尾长直接相关，并携带与肽聚糖水解及细胞壁穿透有关的保守基序。
分枝杆菌噬菌体的裂解系统通常由裂解素A（LysA）、裂解素B（LysB）和穿孔素（Holin）构成经典双组分或协同裂解释放体系。LysA主要水解宿主肽聚糖骨架，LysB则特异性作用于分枝菌酸等脂质成分，二者协同完成对分枝杆菌复杂细胞壁的彻底破坏。Holin为疏水性膜蛋白，通过在宿主细胞膜上形成孔道，促进裂解酶外排，其表达调控直接决定裂解时序与效率。部分缺失Holin的噬菌体则可借助信号肽介导的分泌路径输出裂解素。
溶原性分枝杆菌噬菌体通常携带整合酶（Int）、噬菌体附着位点（attP）和阻遏蛋白等整合系统元件。整合酶通过介导噬菌体 `attP` 与宿主 `attB` 位点之间的位点特异性重组，实现前噬菌体整合。阻遏蛋白则通过结合调控区域抑制裂解相关基因转录，从而维持溶原状态。某些噬菌体还编码切除酶（Xis），可诱导前噬菌体切除并启动裂解周期。除核心功能基因外，分枝杆菌噬菌体还编码DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶和胸苷酸合成酶等复制、修复与代谢相关蛋白，以及若干转录调控因子。值得注意的是，其基因组中还富含大量功能尚未明确的假定蛋白，提示该类噬菌体仍存在巨大未开发的功能潜力。
1.3 The lysogenic and lytic cycles
分枝杆菌噬菌体的生活周期遵循典型的噬菌体—宿主共进化规律，基本分为裂解周期与溶原周期两种形式。裂解型噬菌体在感染后以染色体外方式复制基因组，最终裂解宿主并释放子代；温和型噬菌体则可整合为前噬菌体，随宿主分裂稳定传递，并在环境刺激下于两种状态间切换。已有大规模基因组与表型分析显示，分枝杆菌噬菌体中温和型与烈性型并存，且不同簇群在生活史类型上具有明显偏向性，这种差异与宿主范围和致病相关性密切相关。
裂解周期通常包括吸附、穿入、生物合成、组装和裂解五个连续阶段。感染起始于噬菌体尾部相关蛋白与宿主受体的特异性识别。由于分枝杆菌细胞包膜由分枝菌酸、肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖等组成，其受体类型具有多样性，已知可作为识别对象的分子包括糖肽脂、海藻糖多酞酸酯和分枝菌酸衍生结构。吸附后，尾部发生构象变化，卷尺蛋白（TMP）的疏水区域穿过尾管并协助突破多层细胞壁结构；某些烈性噬菌体的卷尺蛋白还具有辅助性肽聚糖酶活性，可形成DNA注入通道，将双链DNA（dsDNA）输送入宿主细胞质。
进入胞质后，噬菌体基因表达呈现严格的时间程序性。感染早期优先表达与DNA复制和转录调控相关的基因，以接管宿主核酸代谢；随后进入中期，产生主要衣壳蛋白、尾部支架组分及辅助装配因子；晚期则启动裂解盒相关转录，为宿主裂解做准备。子代病毒粒子的形成遵循模块化装配原则，复制后的DNA在门户蛋白介导下被包装入前衣壳，随后完成尾部聚合及附属结构装配，形成成熟感染性颗粒。簇内主要衣壳蛋白、门户蛋白和尾部装配蛋白在氨基酸水平上的高度保守性，是其精确装配与结构稳定性的分子基础。
分枝杆菌噬菌体裂解宿主依赖LysA、LysB和Holin组成的三元裂解系统。Holin在感染晚期聚集于细胞质膜并形成微孔，促进内裂解酶释放；LysA通过糖苷酶或酰胺酶活性裂解肽聚糖中的 `β-1,4` 糖苷键或酰胺键；LysB作为分枝菌酰阿拉伯半乳聚糖酯酶，特异性切断分枝菌酸与阿拉伯半乳聚糖之间的共价连接，从而破坏富脂外层屏障。部分缺失Holin的噬菌体仍可通过Sec依赖型分泌途径输出携带N端信号肽的LysA，维持裂解能力。相关研究显示，其裂解动力学通常为 `60–90 min`，在适宜感染复数（MOI）条件下，单细胞裂解可释放约 `100` 个子代病毒粒子。
溶原作用则体现为温和型噬菌体与宿主长期共存的适应策略，主要经历整合、维持和诱导三个阶段。整合通常由整合酶催化噬菌体 `attP` 与宿主 `attB` 之间的位点特异性重组完成，且多数优先选择宿主tRNA位点，以降低整合对宿主适应度的影响。部分分枝杆菌噬菌体还演化出非典型溶原策略，例如将 `attP` 位点嵌套于阻遏蛋白编码区内，形成依赖整合的免疫调控体系。此类机制使游离噬菌体编码的阻遏蛋白因C端降解标签而不稳定，只有在整合后去除该标签，阻遏蛋白方可成熟并稳定维持溶原状态，同时赋予宿主抗再感染免疫。
溶原状态的长期维持依赖阻遏蛋白持续占据前噬菌体操纵子或启动子区域，以表观遗传方式沉默裂解基因表达。超感染免疫是溶原宿主的重要防御表型之一，阻遏蛋白不仅抑制本体前噬菌体裂解基因，还可通过竞争性结合启动子来抑制外来噬菌体早期基因表达。由溶原向裂解的转变主要由宿主应激信号触发，核心机制涉及阻遏蛋白的失活或降解。除经典阻遏调控外，某些噬菌体还编码与宿主严格反应相关的附加调控因子，提示噬菌体生活史转换可能受到更复杂的代谢和环境信号控制。
1.4 Promising mycobacteriophages
分枝杆菌噬菌体作为遗传工程平台的应用正在持续拓展。基于噬菌体复制子构建的系统已被用于跨物种大段DNA片段克隆，突破了分枝杆菌大基因片段操作中的关键技术瓶颈。近年来，该领域在噬菌体—宿主互作、分子机制解析和临床转化探索等方面均取得显著进展，为建立更完整的理论体系奠定了基础。相关候选噬菌体不仅可用于基因组工程，还可用于挖掘编码产物的多功能利用价值，以及为应对抗菌药物耐药性提供新工具。文中列举的代表性噬菌体涵盖不同历史形态分类、来源、宿主谱和生活史类型，体现出其在诊断、治疗及工程化改造中的多样潜力。
1.5 Defense and counter-defense mechanisms in mycobacterium–phage interactions
在长期进化压力下，分枝杆菌形成了层级化、多模块的抗噬菌体防御体系，可在吸附、注入、复制与扩散等多个阶段限制噬菌体感染。与之对应，噬菌体则通过基因组变异、功能基因获取和调控网络重塑不断发展反制策略，形成动态持续的共进化军备竞赛。
首先，阻断噬菌体吸附是分枝杆菌最直接的防御方式，主要通过改变细胞壁组成或遮蔽表面受体实现。研究表明，细胞包膜脂质成分与噬菌体吸附效率密切相关。以脓肿分枝杆菌为例，菌落形态与噬菌体敏感性存在显著关联：表面具有糖肽脂（GPLs）的光滑型菌株往往更耐受感染，而缺失GPLs的粗糙型菌株通常更易感。海藻糖多酞酸酯（TPPs）还可作为某些噬菌体感染所必需的共受体，其生物合成基因受损可阻断结合并赋予耐受性。另一个重要例子是 `lsr2` 基因失活，它可解除对脂寡糖相关基因岛的抑制，导致细胞壁脂质重塑并妨碍特定噬菌体受体识别。某些膜相关DNA外切酶或应激相关因子的表达变化，也可能通过改变细胞表面结构促进抗噬菌体表型形成。
当噬菌体成功吸附并尝试注入遗传物质后，分枝杆菌还会启动细胞内防御。前噬菌体介导的异源免疫是重要屏障之一，溶原菌可通过超感染排斥或同源免疫抵御继发感染。部分前噬菌体编码蛋白可专门阻止特定簇噬菌体进入，扩大防御谱，这在脓肿分枝杆菌临床分离株中尤为常见，并被认为是不同菌株间噬菌体敏感性差异的重要来源。除前噬菌体机制外，分枝杆菌还依赖限制—修饰系统（R–M）识别并降解未甲基化外源DNA，同时保留对自身基因组的保护。结核分枝杆菌还保有III-A型CRISPR-Cas系统，可通过获取外来噬菌体序列形成间隔区，转录产生 `crRNAs` 并引导Cas复合体对同源入侵核酸进行特异性切割，建立可遗传的适应性免疫。
在上述屏障之外，流产感染（Abi）系统构成分枝杆菌应对噬菌体感染的末端防线。这一“利他性”程序性死亡机制通过牺牲已感染细胞来保护周围菌群。当噬菌体突破吸附抑制和DNA降解屏障后，宿主可感知异常病毒活动并激活Abi蛋白，进而抑制噬菌体DNA复制或蛋白合成，最终诱导细胞死亡，阻断噬菌体扩增与传播。某些遗传背景变化不仅影响吸附，还可在高感染复数（MOI）条件下触发尚未完全阐明的流产感染途径，说明防御层之间存在复杂耦联。
面对宿主不断强化的防御架构，分枝杆菌噬菌体也演化出多层次反防御策略。部分温和型噬菌体可直接整合进入CRISPR-Cas位点，从而破坏宿主免疫监视；另一些噬菌体则编码抗CRISPR（Acr）蛋白，通过抑制Cas核酸酶活性逃避免疫识别。烈性噬菌体还可通过加快裂解动力学缩短感染周期，在宿主防御系统完全激活前完成扩增。由于尾部结构蛋白决定宿主吸附特异性，这些蛋白常发生高频突变以适应受体变化并恢复感染能力。某些噬菌体还能劫持宿主丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路，沉默类似BREX的防御岛表达，或编码宿主样调控蛋白模拟关键转录因子功能，从而逆转宿主抗性。总体而言，分枝杆菌—噬菌体之间形成了高度复杂的防御—反防御网络，这既揭示了其基础生物学特征，也提示临床噬菌体治疗需通过噬菌体鸡尾酒或精准基因组工程等策略克服宿主耐受。
2 Applications of bacteriophages
分枝杆菌属包括多种具有重要公共卫生意义的病原体，如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌。它们可在土壤、水体和乳制品等生态位中持续循环，体现出跨宿主、跨环境传播特征。随着多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）分枝杆菌问题加剧，传统治疗面临疗程延长、毒性增加与成本上升等挑战。从同一健康（One Health）视角看，噬菌体干预可在动物源头控制、食品链生物监测和环境中抗菌选择压力降低等多个层面协同作用，从而切断传播链并减缓耐药扩散。
2.1 Applications of mycobacteriophages in human health
在人类健康领域，分枝杆菌噬菌体首先展现出突出的快速检测与药敏评估价值。噬菌体依赖活菌完成感染并形成裂解信号，且具有高度宿主特异性，因此可用于活菌检测。广宿主谱裂解型噬菌体D29因在酸性和低氧条件下仍保持稳定，被广泛用于潜伏性结核分枝杆菌的快速检测。在此基础上，通过向TM4、D29、`phAE159` 和 `Φ
2GFP10` 等噬菌体基因组中插入荧光蛋白或荧光素酶表达盒，构建了报告噬菌体体系，可在感染活分枝杆菌后输出可量化生物发光信号，用于高灵敏诊断和表型药敏试验。噬菌体扩增检测（PAA）则通过监测抗生素压力下噬菌体复制变化，实现病原检测与耐药判定同步化，并显著缩短多耐药结核筛查时间。
除扩增检测外，噬菌体或其受体结合蛋白（RBPs）还可功能化电化学与表面等离子体共振（SPR）传感界面，实现不依赖噬菌体复制过程的快速识别。源自SWU1的生物发光传感器可用于临床样本中微量分枝杆菌的快速富集与检出。噬菌体来源的内溶素和结合蛋白还可被工程化为免疫捕获或富集工具，提高复杂样本中分枝杆菌回收效率。这类生物传感平台可进一步与微流控芯片、电化学检测或等温扩增技术整合，构建紧凑、自动化的诊断系统，尤其适用于资源有限地区和基层卫生机构。
在治疗方面，分枝杆菌噬菌体已不再仅被视为抗生素替代物，而是被纳入更综合的精准干预框架，包括源头预防、靶向递送优化和协同杀菌增强。通过删除溶原模块避免水平基因转移、改造尾纤维以扩展宿主谱、整合CRISPR-Cas系统实现耐药基因序列特异性切除等工程策略，噬菌体治疗能力显著提升。具有代表性的案例是利用BRED技术删除BPs噬菌体阻遏基因 `33` 后得到的 `BPsΔ33`，其已在针对播散性脓肿分枝杆菌感染的个体化同情治疗中显示出良好的安全性与临床效果，成为后续大规模随机对照试验的重要概念验证。当前，噬菌体与抗分枝杆菌药物联合应用正被作为多耐药结核、广泛耐药结核和难治性非结核分枝杆菌感染的探索性治疗方案，且其用药决策越来越依赖菌株药敏谱与噬菌体裂解谱的联合评估。
2.2 Applications of mycobacteriophages in animal health
在动物健康领域，噬菌体方法主要应用于牛结核和副结核等重要人兽共患分枝杆菌病的快速诊断与活菌定量。诸如 `Actiphage?` 等商业化系统及其优化的噬菌体扩增方法，可敏感检测新鲜羊乳或牛乳中的活副结核分枝杆菌，并将牛分枝杆菌诊断时间从数周培养周期压缩至 `24–48 h`。进一步发展的 `Actiphage Rapid` 技术将噬菌体裂解与重组酶聚合扩增（RPA）结合，可在不足 `6 h` 内完成检测，并在牛结核阳性牛群中表现出较高灵敏度。基于此的 `Phage-LAMP` 平台又把噬菌体介导裂解释放的胞内DNA直接作为环介导等温扩增模板，在 `1 h` 内实现指数级信号放大，对结核分枝杆菌复合群、牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌均显示出较低检出限，且无需昂贵热循环仪，具有明显的现场应用潜力。对散装奶罐和血液样本的比较研究进一步表明，噬菌体扩增法在副结核分枝杆菌检出率上明显优于传统培养，显示出其在监测和防控中的实用价值。
2.3 Applications of mycobacteriophages in environmental control and ecological surveillance
在环境控制与生态监测方面，环境并非被动背景，而是维持分枝杆菌持续存在和跨界传播的重要储库。因此，在养殖系统、食品生产链、水体/污水体系以及职业暴露环境中建立针对活病原体的监测与风险评估架构，是切断传播链的关键环节。基于噬菌体只能识别具有复制活性的活菌这一特性，分枝杆菌噬菌体技术在环境健康评估中具有独特优势。
养殖环境可因感染动物经粪便、乳汁和呼吸道分泌物排菌而受到污染，使土壤、垫料、水系统和生物气溶胶成为长期储库。针对复杂环境样本中背景菌负荷高、目标菌丰度低的问题，将磁珠捕获与噬菌体裂解结合的混合方法在大规模环境监测中表现出良好一致性，尤其适合评估污水处理过程中的活分枝杆菌持续性以及畜禽废弃物系统中的动态污染水平。配合下游分子检测的噬菌体预富集平台还可提高低负荷分枝杆菌检出率，为暴发前预警和靶向环境干预提供支持。
在食品安全方面，牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌可经受污染原料乳进入乳制品加工系统。已有监测发现，活副结核分枝杆菌可存在于零售乳、乳粉和干酪等产品中，提示其在食品链中的长期持留及消费者暴露风险。若在屠宰前或养殖阶段应用噬菌体干预，有望从源头降低进入加工环节的病原负荷。研究还显示，噬菌体鸡尾酒可在乳基质中于 `24 h` 内清除耻垢分枝杆菌且无再生长，提示其在食品加工中控制分枝杆菌污染具有创新潜力。与传统化学消毒或抗生素处理相比，噬菌体在生物膜中可自我扩增并持续释放内溶素，因此在食品接触表面生物膜治理方面具有独特优势。
职业暴露监测是同一健康框架下的另一关键应用场景。医疗机构、结核隔离病房、临床微生物实验室、畜牧场和屠宰场均是分枝杆菌暴露高风险环境。医务人员结核风险显著高于一般人群，而兽医、农场工人和屠宰从业者同样处于高危位置。动物保定、粪污清理和高压冲洗等活动可产生含分枝杆菌的可吸入气溶胶。噬菌体检测平台已在水、污水和食品样本中得到成功应用，这为其扩展至职业环境中活分枝杆菌负荷监测提供了技术和概念基础。若将此类活病原监测体系纳入职业健康框架，有望推动防控模式由被动个案发现转向主动暴露前环境风险识别。
总体而言，在同一健康（One Health）框架下，分枝杆菌噬菌体的应用已从单一宿主、单一场景逐步转向覆盖人类健康、动物健康与环境治理的多域整合部署。其潜力不仅在于替代或增强抗生素以应对耐药感染，更在于支撑跨边界风险治理与生态调控。随着合成生物学、系统流行病学和环境微生物组学的持续融合，分枝杆菌噬菌体有望发展为贯穿“人—动物—环境”界面的精准生物调控工具，为分枝杆菌病的长期可持续控制提供创新路径。
