hispidulin负载羧甲基纤维素钠纳米粒的制备：表征、生物学活性及分子机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Formulation of hispidulin-loaded sodium carboxymethyl cellulose nanoparticles: characterisation, biological activities and molecular insights

　　

背景：hispidulin是一种具有抗氧化和抗肿瘤潜力的生物活性黄酮类化合物，但因其水溶性和稳定性差而限制了其在治疗中的应用。本研究旨在开发一种合适的纳米载体系统以提高其生物利用度和生物学功效。方法：采用离子交联法制备hispidulin负载羧甲基纤维素钠纳米粒（HIS-CMC NPs）。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）和热重分析（TGA）进行物理化学表征，并结合显微镜分析。测定包封率和载药量。进行体外药物释放和动力学模型研究。评价抗氧化、抗炎、金属螯合、脂质过氧化抑制、血液相容性、溶栓活性以及细胞毒性（MCF-7和3T3-L1细胞）等生物学活性。采用Hoechst和TMRE染色评估细胞凋亡和线粒体膜电位。同时进行VEGFR分子对接和ADMET分析。结果：HIS-CMC NPs的水动力学粒径为243.3 nm，zeta电位为?39.1 mV，表明具有良好的稳定性。实现了高包封率（94.84% ± 1.2%）和载药量（35.13% ± 1.5%）。药物呈缓释特性（pH 5.4条件下87.5% ± 1.3%），符合Korsmeyer-Peppas动力学模型。与游离hispidulin相比，纳米粒表现出增强的抗氧化、抗炎和金属螯合活性。其血液相容性良好（3.60%）且具有溶栓活性（69.62%）。对MCF-7细胞具有选择性细胞毒性（IC₅₀ = 35.33 μg/mL），而对3T3-L1细胞毒性极小。生物聚合物纳米粒在MCF-7细胞中诱导细胞凋亡和线粒体去极化。分子对接研究显示其与VEGFR具有强结合亲和力（?9.7 kcal/mol），并得到良好ADMET性质的支持。结论：HIS-CMC NPs表现出改善的稳定性、缓释特性和增强的生物学活性，表明其作为抗癌应用有效纳米载体的潜力。

天然生物聚合物因生产成本低廉、来源丰富、生物可降解、低毒性和良好的生物学特性而备受关注。与传统药物递送系统相比，生物聚合物纳米粒能够增强稳定性、防止pH降解并实现精准药物递送。然而，许多研究仍存在生物学验证不足、机制 insight 缺乏以及物理化学、生物学和计算层面综合评估不够等问题。hispidulin（4′, 5, 7-三羟基-6-甲氧基黄酮）是一种具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性的黄酮类化合物，但其水溶性差、细胞摄取有限和非特异性分布等缺陷限制了其治疗应用。为此，研究人员开展了hispidulin负载羧甲基纤维素纳米粒（HIS-CMC NPs）的构建与系统评价研究，以期克服游离hispidulin的局限性，提升其理化稳定性和生物利用度。该研究成果发表于《Frontiers in Pharmacology》。

该研究采用的主要关键技术方法包括：离子交联法制备纳米粒；紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）、热重分析（TGA）、场发射扫描电子显微镜（FESEM）和高分辨透射电子显微镜（HRTEM）进行多维表征；透析袋法进行药物释放研究；DPPH自由基清除、金属螯合、脂质过氧化抑制和蛋白质变性抑制等生化实验评价生物学活性；MTT法检测细胞毒性；Hoechst 33342和TMRE荧光染色分析细胞凋亡和线粒体膜电位变化；采用SwissADME和ProTox-II进行ADMET预测和毒性 profiling；运用AutoDock Vina进行分子对接研究，靶蛋白包括VEGFR（PDB ID: 4AG8）、BCL-2（PDB ID: 4MAN）、ERα（PDB ID: 1G50）和MCL-1（PDB ID: 5FDO）。

**表征结果** 通过UV-Vis分析发现，HIS-CMC NPs在254 nm、328 nm和380 nm处出现峰位红移、强度降低和峰展宽，表明药物与聚合物基质之间存在分子间相互作用。XRD分析显示，纯hispidulin具有尖锐的衍射峰，呈高度结晶性；而CMC在2θ = 20.1°处显示宽峰，为半结晶性。HIS-CMC NPs呈现宽化和弥散的衍射峰，提示药物成功包封于无定形基质中，仅残留少量结晶性。FTIR光谱中，HIS-CMC NPs的O-H伸缩振动带移至3344 cm^-1，3200–3500 cm^-1区域展宽，表明hispidulin与CMC之间存在氢键作用；1410 cm^-1、1330 cm^-1和1067 cm^-1处的特征峰同时证实了两种组分的共存。DLS测得水动力学粒径为243.3 nm，多分散指数（PDI）为0.181，zeta电位为?39.1 mV，表明纳米粒分散良好且具有较好的胶体稳定性。AFM显示纳米粒具有纳米级表面粗糙度和均匀分散性。TGA呈现三阶段降解：150°C以下失重10.48%（水分挥发）、200–500°C失重64.19%（CMC骨架和包封药物分解）、500°C以上失重21.36%（残余碳质分解），表明体系具有足够的热稳定性。FESEM显示纳米粒呈不规则棒状、团聚且表面粗糙，粒径约160 nm；HRTEM进一步确认其不均匀棒状结构、边缘光滑，粒径约150.35 nm，选区电子衍射（SAED）显示为半结晶性。包封效率方面，10:1比例的HIS-CMC NPs具有更高的包封率（94.84% ± 1.2%）和载药量（35.13% ± 1.5%），较20:1比例更优，故选用于后续研究。

**药物释放与动力学** 体外释放研究显示，HIS-CMC NPs在pH 5.4（模拟肿瘤微环境）和pH 7.4（正常生理条件）下均呈两相释放模式：初期突释后持续缓释24小时。pH 5.4条件下累积释放率达87.5% ± 1.3%，显著高于pH 7.4的70.83% ± 0.5%，表明体系具有pH响应性，在酸性环境中释放增加16.67%。动力学模型拟合结果表明，Korsmeyer-Peppas模型具有最佳拟合度（pH 5.4时R² = 0.953，pH 7.4时R² = 0.934），释放指数n分别为0.361和0.541，提示pH 5.4时为Fickian扩散机制，pH 7.4时为非Fickian扩散行为。

**生物学活性** 抗氧化活性方面，DPPH自由基清除实验显示HIS-CMC NPs（100 μg/mL时90.48% ± 0.675%）显著高于游离hispidulin（79.45% ± 0.28%），IC₅₀从21.21 ± 1.32 μg/mL降至19.87 ± 1.29 μg/mL。金属螯合实验中，HIS-CMC NPs在100 μg/mL时螯合率为84.15% ± 0.12%，较游离hispidulin（77.26% ± 0.82%）提高约6.89%，IC₅₀从36.59 ± 1.56 μg/mL降至29.94 ± 1.47 μg/mL。脂质过氧化抑制实验中，纳米粒抑制率达80.69% ± 0.11%，较游离药物（76.08% ± 0.17%）提高约4.61%，IC₅₀从19.62 ± 1.29 μg/mL降至14.56 ± 1.16 μg/mL。

**抗炎活性** HIS-CMC NPs（100 μg/mL时85.91% ± 0.30%）显著优于游离hispidulin（77.62% ± 0.39%），IC₅₀降低约25.5%（从20.08 ± 1.30 μg/mL降至14.96 ± 1.17 μg/mL），表明纳米包封增强了抗炎功效。

**血液相容性与溶栓活性** 溶血实验显示HIS-CMC NPs的溶血率仅为3.60% ± 0.03%，远低于5%安全阈值，与阴性对照（PBS）无显著差异，表明良好的血液相容性。溶栓活性方面，HIS-CMC NPs（69.62% ± 0.09%）较游离hispidulin（56.29% ± 0.07%）提高13.33%，虽低于阳性对照链激酶C（87.48% ± 1.04%），但显示了增强的纤溶潜力。

**细胞毒性与凋亡研究** 对正常3T3-L1细胞，HIS-CMC NPs在各浓度下细胞存活率均高于80%（100 μg/mL时84.36% ± 0.74%），IC₅₀为255.2 ± 2.40 μg/mL，显示良好安全性。对MCF-7乳腺癌细胞，HIS-CMC NPs表现出显著增强的细胞毒性（100 μg/mL时细胞存活率17.24% ± 0.36%），IC₅₀从76.60 ± 1.84 μg/mL降至35.33 ± 1.54 μg/mL，选择性指数提高。Hoechst 33342染色显示，HIS-CMC NPs处理的MCF-7细胞凋亡指数为79.16% ± 0.34%，为游离hispidulin（42.24% ± 0.28%）的1.9倍，表现为明显的核固缩和碎裂。TMRE染色显示，HIS-CMC NPs处理后线粒体膜电位荧光降至40.61% ± 0.33%，较游离hispidulin（65.21% ± 0.42%）降低38%，表明更强的线粒体去极化和功能障碍。

**计算研究** ADMET预测显示，hispidulin分子量300.26 g/mol，符合Lipinski规则，具有适中亲脂性（Consensus Log P 2.12）、高胃肠道吸收和良好口服生物利用度（0.55），不能透过血脑屏障，非P-糖蛋白底物，但可能抑制CYP1A2、CYP2D6和CYP3A4。毒性预测显示其口服LD₅₀为4000 mg/kg，属毒性5级，对免疫毒性、神经毒性、肝毒性和细胞毒性等靶点大多为 inactive。分子对接结果表明，hispidulin与VEGFR结合亲和力最强（?9.7 kcal/mol），其次为MCL-1（?8.0 kcal/mol）、ERα（?7.9 kcal/mol）和BCL-2（?7.2 kcal/mol）。与VEGFR的相互作用涉及LEU1035、ASP1046、CYS1045、PHE1047和ALA866残基，包括π-π堆积、范德华力、π-烷基、π-硫及氢键等多种作用模式。

讨论部分综合分析了HIS-CMC NPs的理化特性与生物学功能之间的关系。研究人员指出，纳米包封通过氢键和离子交联作用实现了药物的有效负载和稳定分散，无定形化转变有利于提高溶解度和生物利用度。pH响应性释放特性使其在肿瘤酸性微环境中具有靶向释放优势。抗氧化、抗炎活性的增强归因于CMC基质改善了药物的水分散性、稳定性和缓释行为。选择性细胞毒性源于纳米粒促进的细胞摄取和持续药物释放，而良好的血液相容性为其静脉给药提供了安全性基础。分子对接揭示的VEGFR强亲和力为hispidulin的抗血管生成机制提供了分子依据，ADMET和毒性预测则支持其作为先导化合物的开发潜力。研究人员也客观指出了本研究的局限性：体外模型简化了复杂的生理环境，缺乏血流、免疫反应等动态因素；抗氧化实验为化学模型，细胞实验不能完全代表体内肿瘤异质性；溶血和溶栓实验为静态条件。因此，尚需体内验证、药代动力学 profile 和长期安全性研究以推进临床转化。

**研究结论**：HIS-CMC NPs的成功制备和多维表征证实了其作为有效药物递送系统的潜力。光谱学、显微学和热分析表征确认了hispidulin在CMC基质中的整合、强分子相互作用及其半结晶性质。纳米粒具有纳米级粒径（150–243 nm）、适宜的负表面电荷（?39.1 mV）、良好的胶体稳定性以及棒状形态。该制剂表现出高热稳定性、高包封率（94.84% ± 1.2%）和高载药量（35.13% ± 1.5%）。其具有pH响应性缓释特性，酸性条件下释放增加（pH 5.4时87.5% ± 1.3%）。生物学实验成功证实了纳米粒相较于游离hispidulin显著增强的抗氧化、抗炎、金属螯合和脂质过氧化抑制活性，以及良好的血液相容性、溶栓活性和对MCF-7细胞的细胞毒性。Hoechst染色显示明显的核固缩和碎裂，证实了增强的凋亡效应；TMRE染色揭示处理后细胞线粒体膜电位降低，表明线粒体功能障碍，支持了HIS-CMC NPs的凋亡潜力。分子对接研究揭示了hispidulin与VEGFR的强结合亲和力，反映其可作用于血管生成；计算ADMET分析表明其具有良好的生物利用度和低毒性。该研究 certainly 提供了一种有前景的生物相容性纳米粒药物递送系统用于hispidulin的有效递送。未来工作应关注体内验证、药代动力学 profile 和长期安全性研究以促进临床转化。