《Frontiers in Immunology》：HK2 knockdown is associated with context-dependent inflammatory and angiogenesis-related transcriptional programmes in glioblastoma cells
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摘要引言：细胞代谢失调是癌症的标志性特征之一，肿瘤细胞会上调糖酵解，并在“Warburg效应”中优先将葡萄糖发酵为乳酸。肿瘤特异性上调的己糖激酶2（HK2）催化糖酵解第一步限速反应，是这一表型的关键驱动因素，并且是胶质母细胞瘤中极具前景的治疗靶点。本研究旨在通
摘要引言：细胞代谢失调是癌症的标志性特征之一，肿瘤细胞会上调糖酵解，并在“Warburg效应”中优先将葡萄糖发酵为乳酸。肿瘤特异性上调的己糖激酶2（HK2）催化糖酵解第一步限速反应，是这一表型的关键驱动因素，并且是胶质母细胞瘤中极具前景的治疗靶点。本研究旨在通过分析模型化已建立胶质母细胞瘤细胞系及患者来源短期细胞培养中HK2敲低（HK2KD）后的转录组后果，识别可作为联合治疗靶点的HK2相关肿瘤过程。方法：采用靶向HK2的siRNA对胶质母细胞瘤细胞系及患者来源短期细胞培养进行HK2KD。利用Seahorse糖酵解应激试验（Glycolytic Stress Test）评估糖酵解活性，并通过RNA测序（RNA sequencing）分析转录组变化。结果：在高HK2表达模型中，HK2KD与糖酵解活性降低及广泛转录重塑相关。结合RNA测序、基因本体论（GO）与通路富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以及基于转录组的扰动匹配分析显示，炎症、免疫相关及血管生成相关基因程序发生协同调节，其中包括细胞因子、趋化因子及促血管生成信号轴。值得注意的是，不同胶质母细胞瘤模型之间的炎症通路应答存在显著分歧，这是本研究的核心发现，提示HK2KD后存在依赖情境的免疫代谢转录变化。讨论：这些发现表明，HK2KD相关的转录变化超出了糖酵解通路本身，并以模型依赖的方式将代谢活性与免疫学及血管生成转录网络联系起来。尽管本研究未直接评估肿瘤微环境的功能效应，但其为理解靶向HK2如何与肿瘤相关信号通路变化相联系提供了转录组学框架，并对胶质母细胞瘤分层代谢治疗与联合治疗策略具有潜在意义。
该文发表于《Frontiers in Immunology》，聚焦胶质母细胞瘤（glioblastoma）中己糖激酶2（HK2）的生物学作用及其潜在治疗价值。研究背景在于，胶质母细胞瘤是成人最常见且恶性程度最高的脑肿瘤之一，现行标准治疗包括手术、放疗及同步/辅助化疗，但患者中位生存期仍仅约15个月，长期生存率极低。造成这一困境的重要原因包括肿瘤高度浸润性、生物学异质性、治疗抵抗以及局部复发几乎不可避免。因此，开发能够选择性靶向肿瘤关键脆弱性的治疗策略，成为胶质母细胞瘤研究中的核心议题。肿瘤代谢重编程，特别是Warburg效应，正是在这一背景下受到广泛关注。HK2作为糖酵解第一步限速反应的关键酶，在正常成人脑组织中表达有限，却在胶质母细胞瘤中普遍高表达，并与不良预后相关，因此被认为是较具肿瘤选择性的代谢治疗靶点。
然而，既往研究虽然已提示抑制HK2可削弱胶质母细胞瘤的糖酵解、增殖、侵袭、血管生成及治疗耐受，但对HK2抑制后更广泛的转录组后果认识仍较有限。研究人员因此提出，本研究不仅要确认HK2对糖酵解的贡献，还要系统识别HK2相关的非经典肿瘤程序，尤其是可能作为联合靶向对象的炎症、免疫和血管生成相关通路。围绕这一目标，研究人员采用已建立的胶质母细胞瘤细胞系与患者来源短期培养细胞，进行HK2敲低（HK2KD）并开展转录组学分析，以构建HK2关联的功能网络图谱。
研究所用主要技术方法可概括如下：研究样本包括已建立细胞系U87-MG、U251-MG及患者来源短期细胞培养，后者来自University of Wolverhampton及The Walton Centre相关生物样本库。研究人员首先采用RT-qPCR检测各模型中HK2表达；随后利用靶向HK2的siRNA实施HK2KD，并通过Seahorse XFp糖酵解应激试验检测细胞外酸化率（ECAR）以评估糖酵解活性。转录组层面，选取U87-MG、IN859和IN2045进行RNA测序（RNA-seq），并结合差异表达分析、基因本体论生物过程（GO BP）富集、KEGG通路富集、STRING蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析以及Connectivity Map（CMap）药物扰动富集分析，以解析HK2KD相关的转录程序及潜在药物线索。
在结果部分，论文首先以“Glioblastoma cell cultures recapitulate patient tumour overexpression of HK2”为题，说明研究模型能够较好重现患者肿瘤的HK2高表达特征。研究人员检测16种胶质母细胞瘤细胞培养模型中的HK2 mRNA水平，发现87.5%的模型相对于正常成人脑组织存在HK2升高，其中U87-MG和IN859升高最显著，而IN2045、UWLV22和IN1472则表现为低表达或无表达。这一结果说明所建模型总体保留了患者肿瘤中HK2异常上调这一关键代谢特征，同时也提示不同肿瘤模型之间存在代谢异质性，部分细胞可能并不依赖HK2驱动的糖酵解。
在“Inhibition of HK2 expression dampens the glycolytic activity of glioblastoma cell cultures”这一节中，研究人员进一步验证HK2高表达是否确与糖酵解活性有关。通过siRNA介导的HK2KD，研究人员在高HK2表达的U87-MG与IN859中观察到基础糖酵解活性显著下降；IN859的最大糖酵解能力也明显降低。相比之下，低HK2表达的IN2045在HK2KD后糖酵解变化并不显著。该结果表明，HK2对高表达模型的糖酵解维持具有重要作用，但HK2KD后仍残留一定基础糖酵解，提示可能存在其他己糖激酶同工酶或辅助代谢途径的补偿。
论文最核心的发现集中于“HK2 expression is associated with inflammatory transcriptional programmes relevant to the glioblastoma tumour microenvironment”这一部分。研究人员对U87-MG、IN859和IN2045在HK2KD后的转录组进行RNA-seq分析，发现高HK2表达的U87-MG和IN859均发生广泛转录重塑，但模式并不一致。U87-MG中共鉴定到363个差异表达基因（DEGs），IN859中为589个，IN2045中为231个。尽管不同模型共享一部分DEGs，如FGF2、MET、PDHX、SDC4和TGFBI等，但整体转录应答具有明显模型差异。尤其值得注意的是，炎症和免疫相关转录程序在U87-MG与IN859之间表现出方向相反或不完全一致的变化，这构成该研究最重要的概念性贡献。
在U87-MG中，GO生物过程富集图谱显示多个炎症和免疫相关过程呈负向z评分，提示整体下调，包括“immune system response”“activation of innate immune response”“inflammatory response”“cytokine signalling pathway”等。STRING网络进一步显示，多种下调的细胞因子和趋化因子之间形成紧密互作簇，如CSF2、TNF-α、TNFSF14、CCL3、CCL3L1，以及IL1α、IL1β、IL6、CXCL3、CXCL5、CXCL8等。这些结果表明，在U87-MG中，HK2KD与慢性炎症和免疫抑制相关信号程序的压低有关，提示HK2可能参与维持胶质母细胞瘤促炎性、免疫抑制性肿瘤微环境相关的转录状态。
而在IN859中，富集分析同样提示炎症、免疫及应激反应过程显著相关，但其中不少过程呈正向z评分。尤其是多种CXCL趋化因子如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6以及受体CCR3、CXCR4上调，表明HK2KD在该模型中并非单纯压制炎症信号，而可能诱发另一类应激性或补偿性免疫相关转录程序。研究人员据此强调，HK2抑制后的免疫代谢效应具有显著情境依赖性，可能受肿瘤内在转录状态与基础炎症状态影响。论文并未对胶质母细胞瘤分型作正式归类，但从结果可见，不同模型对代谢扰动的免疫转录反应并不统一，这对于未来精准分层治疗具有重要启示。
在“HK2KD disrupts angiogenesis-associated transcriptional programmes in glioblastoma”部分，研究人员总结了HK2KD对血管生成相关程序的影响。U87-MG中多项与血管生成有关的生物过程富集，并伴随多种促血管生成分子下调，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、CSF2、CXCL8、ANGPT1和ADM。IN859中则显著下调了肿瘤血管生成关键因子VEGFA。值得注意的是，FGF2这一重要促血管生成生长因子及其协同分子SDC4在所有HK2KD模型中均下调，此外MMP-9、MMP-2、MMP-7等与基质重塑和侵袭相关分子也受到抑制。研究人员据此认为，HK2不仅与糖酵解相关，也与支持胶质母细胞瘤血管生成的转录程序相关，提示HK2靶向可能间接影响肿瘤血管生态。
在“Identification of candidate compounds with transcriptional concordance to HK2KD”部分，研究人员进一步利用dpGSEA-CMap策略，尝试寻找能在转录层面模拟HK2KD效应的小分子化合物。分析基于U87-MG与IN859中共同下调的DEGs，最终识别出24种具有转录一致性的候选化合物，包括Ketoconazole、luteolin、apigenin、piperlongumine、MG-262、Vorinostat、Trichostatin A等。研究人员指出，这一结果主要用于探索性假设生成，而非直接形成药物优先级排序，但其为HK2相关治疗再定位和联合治疗策略提供了线索。
讨论部分强调，本研究建立了一个超越经典糖酵解通路的HK2关联转录组框架。研究显示，HK2KD后最重要的变化不是糖酵解基因集本身的富集，而是炎症、免疫及血管生成网络的系统性重塑。尤其是在高HK2表达模型中，HK2与肿瘤相关炎症细胞因子、趋化因子及促血管生成信号存在明显联系，但这一联系具有模型依赖性。研究人员据此认为，HK2可能不仅是代谢酶，还与免疫代谢转录调控相关。与此同时，论文也明确指出局限性：所有实验均基于肿瘤细胞单培养体系，尚未直接验证细胞因子分泌、免疫细胞趋化或血管生成的真实功能后果；RNA-seq生物学重复数有限；HK2KD后的残余糖酵解也提示潜在代谢补偿。
研究结论部分可译为：总之，对HK2KD胶质母细胞瘤细胞培养的RNA测序分析揭示了超出经典糖酵解通路范围的广泛转录重塑，提示HK2可能与该脑肿瘤中的炎症、免疫及血管生成相关调控网络有关。HK2KD U87-MG与IN859之间出现的分歧性炎症相关表达应答表明，HK2可能参与调节依赖情境的免疫代谢转录程序，而这种调节可能受到肿瘤内在转录状态和炎症状态的影响。总体而言，这些转录组数据扩展了当前对胶质母细胞瘤中HK2生物学功能的认识，使其不再局限于代谢本身，并提示HK2的治疗性抑制可能在不同胶质母细胞瘤亚型或细胞状态中差异性影响免疫相关基因表达模式。整体来看，该研究支持在分子分层的胶质母细胞瘤模型中，进一步探究HK2相关转录程序及其与免疫治疗和抗血管生成治疗策略之间的潜在关联。
