真菌病毒组（Mycovirome）分析揭示禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）中丰富的病毒多样性与进化启示

《Phytopathology Research》：Mycovirome analysis unveils rich viral diversity and evolutionary insights in Fusarium pseudograminearum

　　

摘要：真菌病毒（Mycoviruses）广泛分布于各大真菌类群中，作为植物病原真菌潜在的生物防治（Biocontrol）因子具有重要前景，后者常造成农业生产重大经济损失。禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）是引起全球小麦冠腐病（Wheat crown rot, FCR）的主要病原，但其相关的真菌病毒种类尚缺乏深入探究。为解析禾谷镰孢菌的真菌病毒组（Mycovirome），研究人员对该病原菌的400个分离株进行了宏转录组（Metatranscriptomic）测序。研究鉴定出80条与真菌病毒物种关联的重叠群（Contigs），其中34个代表新种。基因组类型分析显示含52种正单链RNA（+ssRNA）病毒、18种负单链RNA（-ssRNA）病毒及10种双链RNA（dsRNA）病毒。基于RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）序列的BTPlastp比对及系统发育分析将其归入12个不同的进化谱系。线粒体病毒属（Mitoviruses）占鉴定病毒的近半数（47.5%），苯纽病毒属（Phenuiviruses）占11.25%。值得注意的是，多种真菌病毒与植物病毒具有同源性，暗示可能的进化联系。本研究首次对禾谷镰孢菌进行了全面的真菌病毒组分析，揭示了显著的病毒多样性，拓展了对真菌病毒群落的认识并为病毒进化研究提供了新视角。

论文解读：禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）真菌病毒组的宏转录组学解析与病毒多样性研究

研究背景与立项依据：

小麦冠腐病（Fusarium crown rot, FCR）由禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）等镰孢菌种引起，是威胁全球谷物安全生产的重要土传病害，可导致巨额经济损失并伴随呕吐毒素（Deoxynivalenol, DON）等霉菌毒素污染。真菌病毒（Mycoviruses）可感染植物病原真菌并引致毒力减弱（Hypovirulence），是极具潜力的环保型生防制剂。尽管镰孢属其他成员（如F. graminearum、F. oxysporum）的真菌病毒已有报道，但F. pseudograminearum中仅记载了6种已知病毒且均为传统方法发现，其病毒组全貌及多样性长期处于空白状态。为填补这一认知缺口并挖掘潜在生防资源，研究人员开展了针对F. pseudograminearum的大规模宏转录组（Metatranscriptomic sequencing）病毒组学调查。该研究成果发表于《Phytopathology Research》。

主要关键技术方法：

研究人员采集中国黄淮冬麦区4个省份共400株F. pseudograminearum分离株，经特异性引物PCR鉴定确证后分组培养提取总RNA，去除核糖体RNA（rRNA depletion）构建Illumina cDNA文库进行高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）。下机数据经Trimmomatic过滤低质量读段，去除宿主（F. pseudograminearum strain CS3096）映射读段后对剩余序列用SPAdes进行从头组装（De novo assembly）获得重叠群（Contigs）。通过NCBI NR蛋白数据库BLASTx/BLASTp比对筛选病毒同源序列，利用MEGA-X及IQ-TREE基于RdRp氨基酸序列构建最大似然（Maximum Likelihood, ML）系统发育树进行分类判定。所有候选病毒contigs均设计特异性引物通过反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）验证存在真实性。

研究结果：

Total RNA sequencing, contig assembly, and RT-PCR（总RNA测序、重叠群组装与RT-PCR验证）：

对400个分离株混合池进行宏转录组测序并生信分析，获得80条病毒相关contigs，经RT-PCR验证均真实存在于真菌宿主中。病毒分属Mitoviridae、Botourmiaviridae、Tymoviridae、Hypoviridae、Mymonaviridae、Mycoaspiviridae、Phenuiviridae、Partitiviridae、Curvulaviridae、Pseudototiviridae、Phlegiviridae及Fusagraviridae共12个病毒科/家族谱系。基因组类型占比为+ssRNA病毒65%（以Mitoviridae最多，占47.5%）、-ssRNA病毒22.5%、dsRNA病毒12.5%，其中34个病毒contigs被判定为新种。

Positive-sense single-stranded RNA mycoviruses——Mitoviridae（正义单链RNA真菌病毒——线粒体病毒科）：

鉴定到38条Mitoviridae序列，依据ICTV <70%氨基酸相似度标准划定8个新种，分属Duamitovirus属（23条）、Unuamitovirus属（12条）及Kvaramitovirus属（3条），未检出Triamitovirus属。RdRp多序列比对显示具典型Mitovirus属6个保守基序（Motifs）。

Positive-sense single-stranded RNA mycoviruses——Botourmiaviridae（正义单链RNA真菌病毒——波图米亚病毒科）：

鉴定6条Botourmiaviridae contigs（含完整RdRp ORF），其中5个为新种，分别归类于Botoulivirus属（FpgBOV1/2）、Magoulivirus属（FpgMOV1/2）及未定属的Botourmia-like virus（FpgBoLV1/1-1），后者与已知属相似度低提示可能为Botourmiaviridae新属。RdRp具典型+ssRNA真菌病毒8个保守基序。

Positive-sense single-stranded RNA mycoviruses——Tymoviridae（正义单链RNA真菌病毒——芜菁黄花叶病毒科）：

鉴定2条Tymoviridae相关contigs（FpgTmLV1及短片段c2941_g1_i1），FpgTmLV1编码部分RdRp且与卤虫（Brine shrimp）tymo-like virus 1有68%一致性，系统树聚于未定类群Tymoviridae分支，属/种分类暂未确定。

Positive-sense single-stranded RNA mycoviruses——Hypoviridae（正义单链RNA真菌病毒——低毒病毒科）：

鉴定6条Hypoviridae片段，包括Betahypovirus属近全长基因组FpgHV1（编码含UGT-RdRp-Hel结构域的多聚蛋白）及其变异株FpgHV1-1，以及Thetahypovirus属部分序列FpgHV2。FpgHV1多聚蛋白具Hypovirus典型UDP-葡萄糖/固醇葡糖基转移酶（UGT）、RdRp及RNA解旋酶（Hel）三个保守结构域。

Negative-sense single-stranded RNA mycoviruses——Mymonaviridae（负义单链RNA真菌病毒——单负链丝状病毒科）：

鉴定3条Mymonaviridae（Sclerotimonavirus属）contigs，FpgSV1与FpgSV2分别近似F. asiaticum及F. graminearum已报负链RNA病毒，基因组含5个不连续ORFs（ORF I-V），RdRp具4个保守基序。

Negative-sense single-stranded RNA mycoviruses——Mycoaspiviridae（负义单链RNA真菌病毒——真菌蛇形病毒科）：

鉴定6条待正式批准的Mycoaspiviridae（Mycoaspivirus属）contigs，含FpgMOV1（近完整RdRp与Trichoderma hamatum mycoophiovirus 1相似度53%）及FpgMOV2（与Fusarium poae negative-stranded virus 1相似度90%）及其各自分离株变体，均只编码RdRp，具5个保守基序并在系统树形成独立分支。

Negative-sense single-stranded RNA mycoviruses——Phenuiviridae（负义单链RNA真菌病毒——苯纽病毒科）：

鉴定9条Phenuiviridae片段，含Mycobunyavirus属候选新病毒FpMBV1-3（8个为新种）、Coguvirus属候选新成员FpgCV1及未定属FpgBLV1/3/4等。RdRp具布尼亚病毒目（Bunyavirales）典型6个保守基序，FpMBV聚类于新提议Mycobunyavirus属，FpgCV1聚于Coguvirus属。

Double-stranded RNA mycovirus——Partitiviridae（双链RNA真菌病毒——双分病毒科）：

鉴定新partiti-like virus（FpgPLV1，近完整RdRp与Streptophyte partitivirus最高相似53%，聚于未定属Partitiviridae分支）及2条短contigs聚类Gammapartitivirus属且与Fusarium mangiferae partitivirus 2（FmPV2）高度相似。

Double-stranded RNA mycovirus——Curvulaviridae（双链RNA真菌病毒——弯孢病毒科）：

鉴定3条Orthocurvulavirus属（Curvulaviridae科）片段，FpgOCV1含完整RdRp且与Fusarium graminearum dsRNA mycovirus 4相似，FpgOCV1-1为其不同株系，另一短contig匹配已知F. pseudograminearum partitivirus 1。

Three virus families within the Alphatotivirinae（Alpha总病毒亚目下的三个病毒科）：

在Alphatotivirineae亚目中发现：Pseudototiviridae科（Victorivirus属）FpgVV1（含gag与pol双ORF编码CP及RdRp）；Phlegiviridae科Phlegivirus属FpgPhV1（完整RdRp ORF）；Fusagraviridae科Fusagravirus属FpgFV1（双ORF编码CP及RdRp，与Fusarium poae fusagravirus 1有60%相似）。三者均为该宿主中首次报道的新真菌病毒。

讨论与结论总结：

讨论指出本研究大幅拓展了F. pseudograminearum病毒组认知，首次在该单一镰孢菌种中发现多类型Mitovirus（缺Triamitovirus），Botourmiaviridae中FpgBoLV1/1-1可能代表新属，Tymoviridae及Phenuiviridae的发现暗示真菌—植物间跨界传播可能，部分Betahypovirus具典型低毒病毒结构域值得后续生防潜力探究。多个真菌病毒与植物病毒同源支持真菌—植物病毒共同祖先或跨界演化假说。

结论（Conclusions）：本病毒宏基因组分析揭示了重要小麦病原F. pseudograminearum中病毒的多样性，有益于探索真菌病毒进化史及扩充F. pseudograminearum侵染病毒库，可为开发生物防治策略提供帮助。