大柴胡汤通过调节肠屏障功能障碍及抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路缓解脓毒症肝损伤

《Chinese Medicine》：Dachaihu decoction alleviates septic liver injury by modulating the intestinal barrier dysfunction and suppressing the NF-κB/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway

　　

背景：肠屏障功能障碍是脓毒症肝损伤(septic liver injury, SLI)的关键驱动因素。大柴胡汤(Dachaihu decoction, DCHD)是?《伤寒论》记载的经典中药复方，广泛用于治疗胃肠及肝脏炎症状态。本研究旨在阐明DCHD对SLI的保护作用及其分子机制。方法：采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)诱导的小鼠脓毒症模型，通过检测血清肝酶、组织病理学、氧化应激、肝细胞凋亡及炎症细胞因子评估DCHD对SLI的治疗效应。经透射电镜、血清生物标志物(D-乳酸、二胺氧化酶DAO、脂多糖lipopolysaccharide, LPS)及紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、E-cadherin)评价肠屏障完整性；16S rRNA测序分析肠道菌群；UPLC-Q-TOF–MS进行DCHD化学成分鉴定；整合网络药理学、生物信息学及转录组学分析筛选潜在机制，并在体内及LPS刺激的永生化小鼠库普弗细胞(immortalized mouse Kupffer cells, ImKCs)中验证；采用TLR4 siRNA基因沉默及TAK-242(TLR4抑制剂)、MCC950(NLRP3抑制剂)进行功能确认。结果：DCHD减轻CLP小鼠肝损伤，表现为改善肝功能、减轻病理损伤、降低氧化应激与炎症、减少肝细胞凋亡。其肝保护作用伴随肠通透性降低及屏障完整性增强，且肠道菌群重塑——有益菌富集、革兰阴性菌(如肺炎克雷伯菌属Klebsiella、肠杆菌属Enterobacter、变形杆菌属Proteus)减少，致LPS产生及向肝脏移位减少。整合网络药理学与转录组学显示NF-κB/NLRP3/Caspase-1轴为核心机制，DCHD下调体内及LPS刺激的ImKCs中p-p65、p-IκBα、NLRP3、ASC及Cleaved Caspase-1。TLR4 siRNA及TAK-242、MCC950处理证实DCHD主要通过NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路减轻肝脏炎性损伤。结论：DCHD可能通过增强肠屏障、减少肠源性LPS向肝脏移位，进而抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1轴缓解SLI，具重要转化潜力。

论文解读：大柴胡汤通过调节肠屏障功能障碍及抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路缓解脓毒症肝损伤

研究背景与目的

脓毒症(sepsis)是由宿主对感染反应失调引起的危及生命的综合征，可导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，全球年发病约4890万例，死亡1100万例。肝脏作为抵御微生物入侵的关键屏障在脓毒症中极易受损，约34.7%的脓毒症患者发生脓毒症肝损伤(septic liver injury, SLI)，合并肝功能异常的脓毒症患者的死亡率较脓毒性肺损伤高出54%。目前SLI确切发病机制未明且缺乏有效干预手段，肠屏障功能障碍("leaky gut")致肠源性毒素(尤其是革兰阴性菌外膜的脂多糖lipopolysaccharide, LPS)移位至肝脏激活库普弗细胞(Kupffer cells, KCs)及TLR4(toll-like receptor 4)/NF-κB(nuclear factor-κB)通路被认为是重要环节。大柴胡汤(Dachaihu decoction, DCHD)源自?《伤寒论》，由柴胡(Bupleurum chinense)、黄芩(Scutellaria baicalensis)、半夏(Pinellia ternata)、枳实(Citrus aurantium)、大黄(Rheum officinale)、生姜(Zingiber officinale)、白芍(Paeonia lactiflora)、大枣(Ziziphus jujuba)组成，前期临床提示可减轻SLI全身炎症，但其机制不清。研究人员假设DCHD通过修复肠屏障、减少肠源性LPS移位、抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1轴缓解SLI，遂开展本研究。论文发表于《Chinese Medicine》。

主要关键技术方法概述

研究人员采用CLP法建立C57BL/6小鼠脓毒症模型，设假手术(sham)、模型(CLP)及DCHD低中高剂量灌胃组，以血清ALT(aspartate aminotransferase)/AST(alanine aminotransferase)、肝组织H&E染色、TUNEL、氧化指标(SOD、MDA、CAT、GSH-Px)、ELISA测细胞因子评价肝损伤；透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)、血清D-乳酸/Diamine Oxidase(DAO)/LPS及结肠紧密连接蛋白ZO-1/Occludin/E-cadherin Western blot评价肠屏障；粪便16S rRNA全长测序分析菌群；UPLC-Q-TOF–MS鉴定DCHD成分；整合网络药理学(TCMSP、SwissTargetPrediction、GEO差异表达基因、GeneCards疾病靶)、肝转录组RNA-seq筛选机制；LPS刺激永生化小鼠Kupffer细胞(ImKCs)加含药血清(DCHD-DS)及TLR4抑制剂TAK-242、NLRP3抑制剂MCC950、siTLR4转染进行体外功能验证。

研究结果

DCHD improves CLP-induced septic mice liver injury

CLP致小鼠24 h死亡率约50%，Murine Sepsis Score(MSS)升高，血清ALT、AST升高，肝组织炎性浸润、坏死，肝组织Il6、Il1β、Tnfα、Cxcl2、Ccl3、Mcp1 mRNA上调，SOD/GSH-Px/CAT活性下降、MDA及ROS升高，TUNEL阳性细胞增多。DCHD干预剂量依赖性地降低死亡率趋势(p=0.045生存曲线)、降低MSS评分，显著降低ALT、AST，减轻肝组织炎症坏死与凋亡，下调促炎因子mRNA及蛋白，恢复抗氧化酶活性、降低MDA与ROS荧光强度。表明DCHD对CLP诱导的SLI具有保肝、抗炎、抗氧化及抗凋亡作用。

UPLC-Q-TOF–MS analysis

从DCHD中鉴定出32个主要成分，包括黄芩苷(baicalin)、山奈酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)等，批次一致性良好。

Network pharmacology analysis

DCHD预测得703个靶点，与GEO脓毒症差异表达基因(1595个)及GeneCards中脓毒症(4321个)和肝损伤(1759个)靶取交集得128个共同靶。PPI网络筛选核心靶基因为ALB、CASP3、AKT1、MMP9、PPARG、HSP90AB1、SRC、EGFR、IGF1。GO富集涉及凋亡负调控、异源刺激反应等；KEGG显著富集TNF、IL-17、TLR、PI3K-Akt、NF-κB等通路，提示DCHD可能经炎症与NF-κB通路发挥保护作用。

Molecular docking

核心成分Genistein、Wogonin、Kaempferol与ALB、MMP9、HSP90AB1对接结合能均<-5.0 kcal/mol，其中与MMP9结合最稳定，分子动力学模拟显示合理柔性。

Effect of DCHD on intestinal barrier integrity in CLP-induced septic mice

CLP小鼠菌群α多样性(Chao1、Shannon)降低，变形菌门(Proteobacteria)增多、拟杆菌门(Bacteroidetes)及Verrucomicrobia(Akkermansia)减少，条件致病菌Klebsiella、Enterobacter、Proteus、Staphylococcus增多；DCHD逆转上述变化，增加Akkermansia与乳杆菌目(Lactobacillales)，恢复α多样性，PLS-DA显示菌群组成趋近sham组。TEM示CLP组结肠上皮紧密连接(tight junction, TJ)破坏、微绒毛缺失，DCHD保护TJ超微结构；Western blot示CLP组ZO-1、Occludin、E-cadherin下调，DCHD上调。表明DCHD重塑菌群、恢复肠屏障紧密连接蛋白表达、降低肠通透性。

Gut-derived LPS translocates to the liver and activates Kupffer cells (KCs)

CLP组血清及肝组织LPS、血清D-乳酸、DAO显著升高；Spearman分析示Akkermansia与血清LPS负相关(p<0.05)，Klebsiella、Enterobacter、Proteus与血清LPS正相关(p<0.05)。肝组织F4/80(成熟组织驻留巨噬细胞标记)与CD11b(活化单核/巨噬细胞整合素)免疫组化示CLP组KCs活化增多，DCHD抑制。说明肠屏障破坏致革兰阴性菌过度生长→LPS入血→经门静脉激活肝内KCs。

Effect of DCHD on the hepatic transcriptional profile in mice with CLP-induced SLI

肝转录组PCA示DCHD组与CLP组分离明显，筛选656个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)；KEGG富集最显著含NF-κB、TNF、IL-17、NLRP3 inflammasome相关通路；核心上调炎症基因(Il1β、Ccl2、Csf3、Ccl3、Il6、Ptgs2等)经DCHD下调。提示DCHD调控肝炎症转录谱，抑制NF-κB介导的炎性基因转录。

DCHD ameliorates sepsis-induced liver injury by regulating TLR4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1 pathway in vivo

CLP组肝TLR4、MyD88、p-IκBα、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA升高；DCHD剂量依赖性下调之，免疫组化示TLR4/MyD88/p65核定位减少。表明DCHD在体内抑制TLR4/MyD88→IκBα磷酸化→NF-κB p65核转位→NLRP3 inflammasome组装及Caspase-1活化。

DCHD-DS mitigates LPS-induced inflammatory injury in ImKCs via inhibition of the NF-κB/NLRP3/Caspase-1 pathway

1 μg/mL LPS刺激ImKCs上调Il6、Il1β、Tnfα mRNA及TLR4/MyD88/p-IκBα/p-p65/NLRP3/ASC/Cleaved Caspase-1/IL-1β，降低SOD与GSH-Px、升高MDA；10% DCHD-DS逆转之。TAK-242(TLR4抑制剂)或siTLR4敲低TLR4后，DCHD-DS额外抑制作用消失；MCC950(NLRP3抑制剂)与DCHD-DS联用无叠加效应。证实DCHD-DS通过同一TLR4→NF-κB→NLRP3/Caspase-1轴发挥抗炎作用，作用于该轴上游TLR4及下游NLRP3节点。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，CLP致菌群失调(有益菌Akkermansia与Lactobacillus减少，革兰阴性条件致病菌Klebsiella、Enterobacter、Proteus扩增)及肠TJ蛋白下调→肠通透性增加→肠源性LPS经门静脉入肝激活KCs的TLR4→MyD88→IκBα磷酸化→NF-κB p65入核→上调pro-IL-1β及NLRP3(priming signal)→NLRP3/ASC/pro-Caspase-1组装 inflammasome→Caspase-1剪切IL-1β及GSDMD→肝细胞pyroptosis与炎症→SLI；DCHD通过重建菌群多样性(提升Akkermansia与Lactobacillales)、上调ZO-1/Occludin/E-cadherin修复肠屏障、减少LPS移位、继而抑制肝TLR4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号轴减轻SLI。UPLC-Q-TOF–MS结合网络药理学提示Genistein、Wogonin、Kaempferol为关键活性成分，已有文献支持其抗炎、抗氧化及NF-κB抑制活性。研究局限性含未同时采用LPS注射模型、未明确单一成分具体贡献、缺粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)或基因敲除因果验证、采样点单一(术后24 h)。

结论翻译：DCHD可通过重塑CLP诱导脓毒症小鼠的肠道菌群结构与多样性、恢复肠屏障完整性，从而减少肠源性LPS向肝脏移位并抑制肝NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路活化，进而减轻SLI相关的炎性损伤，为其用于脓毒症相关肝功能障碍治疗提供了临床前依据。