《Cancer Immunology, Immunotherapy》：BAP1 loss impairs IFN-γ signaling and enhances NK cell-mediated cytotoxicity in myeloid leukemia
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自然杀伤（Natural Killer, NK)细胞通过多种受体-配体相互作用识别并清除恶性细胞。为揭示髓系白血病细胞对NK细胞毒性的遗传决定因素，研究人员分析了多项全基因组CRISPR筛选。在反复出现的候选基因中，BRCA1相关蛋白1(BRCA1-assoc
自然杀伤（Natural Killer, NK)细胞通过多种受体-配体相互作用识别并清除恶性细胞。为揭示髓系白血病细胞对NK细胞毒性的遗传决定因素，研究人员分析了多项全基因组CRISPR筛选。在反复出现的候选基因中，BRCA1相关蛋白1(BRCA1-associated protein 1, BAP1)基因作为保护K562白血病细胞免受NK细胞杀伤的关键因素出现。利用BAP1敲除(Knockout, KO)模型，研究人员发现单独BAP1缺失并不改变NK细胞敏感性。然而，在干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)刺激下，BAP1 KO K562细胞表现出HLA I类分子诱导减少、触发增强的NK细胞脱颗粒，并显示出比野生型(Wild-type, WT)细胞更高的NK细胞介导的细胞毒性敏感性。进一步实验揭示BAP1缺陷细胞表现出IFN-γ受体1(IFN-γ receptor 1, IFN-γ-R1)表达降低。在多种髓系白血病细胞系中，BAP1敲低在ASXL1突变背景下选择性地降低HLA-E和IFN-γ-R1表达。这些发现提示BAP1可能参与调控髓系白血病中IFN-γ反应性和免疫逃逸。
本研究发表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》，聚焦于髓系白血病中BAP1基因对NK细胞介导的细胞毒性的调控作用及其分子机制。
**研究背景与目的**
NK细胞是机体重要的免疫效应细胞，能够不依赖于特异性新抗原呈递而识别并杀伤下调HLA I类分子表达的恶性细胞，在包括髓系白血病在内的多种肿瘤防御中发挥关键作用。髓系白血病是一类以骨髓中未成熟髓系细胞异常增殖为特征的异质性血液系统恶性肿瘤，其中急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)尤为突出。ASXL1（Additional Sex Combs-Like 1）是髓系恶性肿瘤中反复突变的表观遗传调控因子，与AML、慢性髓单核细胞白血病(Chronic Myelomonocytic Leukemia, CMML)和慢性髓系白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML)的不良预后相关。ASXL1通过多梳抑制复合物2(Polycomb Repressive Complex 2, PRC2)介导的转录抑制以及与其结合形成多梳抑制去泛素化酶(Polycomb Repressive Deubiquitinase, PR-DUB)复合物参与表观遗传调控。BAP1作为PR-DUB复合物的核心组分，通过去除组蛋白H2A的泛素化促进白血病发生，因此被视为ASXL1突变髓系疾病的潜在治疗靶点。多项全基因组CRISPR筛选已用于鉴定调控肿瘤细胞对NK细胞敏感性的分子结构，其中BAP1反复出现在基因耗竭侧，提示其可能保护肿瘤细胞免受NK细胞杀伤。鉴于BAP1在髓系白血病中的功能重要性及其与ASXL1的密切相互作用，研究人员旨在系统探究BAP1在调控NK细胞反应性和IFN-γ信号传导中的具体作用，以期为联合靶向BAP1与NK细胞免疫治疗提供理论依据。
**主要技术方法**
本研究整合分析了两组公开的全基因组CRISPR筛选数据；利用CRISPR/Cas9技术构建BAP1 KO K562细胞系并通过荧光激活细胞分选(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)获得单克隆细胞；采用小干扰RNA(Small-Interfering RNA, siRNA)技术在多种髓系白血病细胞系（K562、MEG-01、PLB-985、OCI-AML2、OCI-AML3）中实现BAP1敲低；从人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)中分离NK细胞并以IL-2激活；运用双靶细胞毒性实验、CD107a脱颗粒实验和酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)评估NK细胞功能；通过流式细胞术和定量实时PCR(Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)检测蛋白及转录水平表达；采用串联质谱标签质谱(Tandem Mass Tag Mass Spectrometry, TMT-MS)技术进行蛋白质组学比较分析；利用公开数据库（OHSU AML数据集，2022）进行生物信息学分析探究ASXL1突变患者中的基因表达特征。
**研究结果**
**BAP1耗竭以IFN-γ依赖性方式增加K562细胞对NK细胞的敏感性**。研究人员首先重新分析了公开的全基因组CRISPR筛选数据集，发现BAP1在多项使用原代NK细胞的筛选中反复出现在基因耗竭侧，其导向RNA均与NK细胞毒性高敏感性相关，提示完整的BAP1表达可保护白血病细胞免受NK细胞毒性。为验证该发现，研究人员利用CRISPR/Cas9技术建立了三种BAP1 KO K562单克隆细胞系。在3小时双靶细胞毒性实验中，未处理条件下BAP1 KO与WT K562细胞对NK细胞杀伤的敏感性无显著差异；但经过IFN-γ预处理后，BAP1 KO细胞呈现显著优势性杀伤。相应地，IFN-γ预处理后NK细胞针对BAP1 KO细胞的脱颗粒水平显著高于WT细胞，而在未处理条件下无此差异。该结果表明BAP1缺失仅在IFN-γ存在时增强靶细胞对NK细胞介导杀伤的敏感性。
**BAP1缺失损害K562细胞对IFN-γ的反应及抗原呈递**。为深入探究BAP1缺失对IFN-γ反应的具体影响，研究人员进行了TMT-MS蛋白质组学分析。结果显示，无论是否经IFN-γ处理，BAP1 KO与WT细胞的蛋白质组特征均存在显著差异，表明BAP1缺失对癌细胞具有广泛影响。特别值得注意的是，大量IFN-γ诱导蛋白在BAP1 KO细胞中显著下调，基因本体论(Gene Ontology, GO)生物学过程和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析表明这些下调蛋白主要富集于抗原呈递通路。流式细胞术和qPCR验证显示，WT K562细胞经IFN-γ处理后HLA I类分子、细胞黏附分子CD54（ICAM1）和CD56（NCAM1）均显著上调，而BAP1 KO细胞的诱导反应明显受损。蛋白质组学虽提示NKG2D配体ULBP1/2在BAP1 KO细胞中上调，但流式细胞术检测ULBP1及ULBP2/5/6表达仅显示微小且无统计学意义的差异，提示该变化不足以解释观察到的NK细胞敏感性增加，HLA I类分子表达改变仍是主要驱动因素。
**BAP1耗竭影响IFN-γ信号通路的上游元件**。为确定BAP1缺失在IFN-γ信号通路中的具体作用位点，研究人员检测了STAT1的表达及磷酸化状态。结果显示，BAP1缺失不影响总STAT1蛋白水平和基础pSTAT1水平，但IFN-γ刺激后BAP1 KO细胞的pSTAT1信号显著减弱。进一步分析发现，BAP1 KO细胞中IFN-γ-R1的蛋白和转录水平均显著降低，表明BAP1缺失通过降低IFN-γ受体表达而在信号通路近端造成损害。
**BAP1在ASXL1突变的髓系白血病细胞中调控抗原呈递和IFN-γ反应**。鉴于BAP1与ASXL1形成功能性PR-DUB复合物，且K562细胞本身携带ASXL1截短突变(Y591Y/X)，研究人员进一步探究了该调控作用是否与ASXL1突变状态相关。分析OHSU AML数据集发现，ASXL1突变患者体内参与IFN-γ反应和抗原呈递的基因mRNA水平显著高于ASXL1 WT患者，支持ASXL1突变-BAP1复合物参与抗原呈递和HLA I类表达的假设。研究人员随后在ASXL1突变的MEG-01细胞和ASXL1 WT的PLB-985、OCI-AML2、OCI-AML3细胞中进行BAP1敲低实验。结果显示，BAP1敲低在MEG-01细胞中显著降低HLA-E和IFN-γ-R1表达，并触发增强的NK细胞脱颗粒；而在ASXL1 WT细胞系中，尽管部分细胞显示IFN-γ-R1蛋白表达降低，但均未重现HLA-E表面表达下降或NK细胞脱颗粒增强的效应。
**讨论与结论**
本研究揭示了BAP1在调控髓系白血病NK细胞抗性和IFN-γ反应性中的新作用，为联合BAP1靶向策略与NK细胞治疗提供了理论依据。研究人员从多项CRISPR筛选的整合分析出发，证实BAP1作为NK细胞毒性的反复调控因子，其缺失在IFN-γ存在条件下显著增强白血病细胞对NK细胞杀伤的敏感性。机制研究表明，BAP1缺失导致IFN-γ-R1表达降低，进而削弱STAT1磷酸化，阻断IFN-γ信号的近端传导，最终损害抗原呈递相关蛋白（尤其是HLA I类分子）的诱导表达。
研究特别强调了ASXL1突变背景在该调控中的重要性。K562细胞携带的ASXL1截短突变导致PR-DUB复合物功能增强，而BAP1敲低在ASXL1突变细胞中选择性降低HLA-E和IFN-γ-R1表达，在ASXL1 WT细胞中则无此效应。OHSU AML数据集的分析进一步支持ASXL1突变与IFN-γ反应/抗原呈递基因高表达的相关性。这一发现提示BAP1-ASXL1功能性复合物可能通过PRC2活性调控H3K27甲基化状态，进而影响抗原呈递和IFN-γ通路相关基因的表达，但该模型尚需进一步实验验证。
研究人员同时注意到调控网络的复杂性：虽然HLA I类分子下调可解除对NK细胞的抑制，但ICAM1等黏附分子的同步降低可能削弱NK-靶细胞间的稳定结合，提示净NK细胞反应是整合多种抑制性、激活信号及黏附依赖性相互作用的结果。NKG2D配体的潜在变化虽被蛋白质组学提示，但未在蛋白水平得到证实。
本研究的临床意义在于：在IFN-γ信号常上调且可致治疗耐药的AML微环境中，尤其在异基因造血干细胞移植后NK/T细胞产生大量IFN-γ的背景下，BAP1缺失导致的IFN-γ反应障碍可能通过降低HLA I类表达而 favor NK细胞介导的细胞毒性，这为开发新型免疫治疗策略提供了新思路。然而，IFN-γ-R1受BAP1调控的具体机制、该现象对T细胞识别的影响，以及ASXL1突变状态的具体贡献程度等，仍有待未来研究阐明。
