中国庭院散养动物中产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBL-Ec, extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli)的遗传多样性及公共卫生意义

《One Health Advances》：Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli in Chinese backyard animals: genetic diversity and public health implications

　　

背景：产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBL-Ec, extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli)在食用动物中的出现对公共卫生构成重大威胁。尽管商品化养殖场中ESBL-Ec的流行率及遗传特征已被广泛研究，但来自庭院散养(backyard farm)系统的数据仍然有限。本研究调查了中国山东省12个村庄庭院散养动物中ESBL-Ec的存在情况。结果：不同动物物种间ESBL-Ec检出率存在显著差异，猪为78.7%、牛61.5%、羊50.0%、鸭28.6%、狗14.1%、鸡11.5%、猫5.3%；此外，从庭院捕获的180只苍蝇中分离出74株ESBL-Ec。基因组分析显示显著的遗传多样性，主要序列分型(ST, sequence type)包括ST10、ST48、ST206和ST744，分布于多种宿主。贝叶斯聚类(Bayesian clustering)显示所有7个谱系(lineage)均分布于至少两个来源，提示频繁种间传播。不同动物来源的部分分离株表现出高度相似性(0–65个单核苷酸多态性,SNP)，表明潜在克隆传播。blaCTX-M-14、blaCTX-M-65和blaCTX-M-55基因为主导型，占检出blaCTX-M变异体的79.1%，预测定位于IncFIB、IncHI2、IncFII和IncX1质粒上。值得注意的是，庭院动物分离株与该地区既往报道的人源及环境源分离株共享ST型和blaCTX-M基因型，提示跨宿主及环境生态位的潜在传播。结论：这些发现凸显庭院养殖系统是ESBL-Ec的潜在贮存库(reservoir)，强调需改善抗菌药物管理(antimicrobial stewardship)和管理措施以限制耐药菌传播。

论文解读：中国庭院散养动物中产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBL-Ec)的遗传多样性及公共卫生意义

本研究发表于《One Health Advances》。

研究背景与目的

β-内酰胺类抗生素是治疗人和动物细菌感染的重要药物，但产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBL-Ec, extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli)的出现严重削弱了头孢菌素类药物的疗效，构成全球公共卫生威胁。在中国，食用动物尤其是商品化养殖场中ESBL-Ec流行率居高不下，且可通过食物链传至人类。庭院散养(backyard farming)作为中国传统养殖模式的重要组成部分（如生猪散养约占总量30%），具有小规模、多物种混养、与人居环境紧密接触的特点，粪便污染及密切接触增加了病原体跨种传播风险。然而，目前关于庭院散养动物中ESBL-Ec的流行状况、分子特征及与人群分离的关联尚属研究空白。为此，研究人员于2015年在中国山东省12个村庄开展调查，旨在明确庭院动物中ESBL-Ec的携带率、耐药与分子流行病学特征，评估其作为耐药菌贮存库及潜在人畜共患传播的风险。

主要关键技术方法概述

研究人员在山东省某县12个村庄769户庭院中采集猪(n=417)、鸡(n=305)、牛(n=13)、羊(n=10)、鸭(n=7)、狗(n=92)、猫(n=19)及后院苍蝇(n=180)的粪便或涂抹标本，使用chromID ESBL选择性培养基分离ESBL-Ec并经MALDI-TOF MS及16S rDNA鉴定。对猪饲养户进行问卷调查并以多因素logistic回归分析ESBL-Ec定植危险因素。采用琼脂稀释法按CLSI及EUCAST标准进行药敏试验。选取代表性分离株(n=243)进行全基因组测序(WGS, Illumina HiSeq X Ten)，利用SRST2进行多位点序列分型(MLST)、Abricate比对ResFinder及VFDB数据库注释耐药(AMR)与毒力基因、ClermonTyping确定系统发育群(phylogroup)、Parsnp构建核心基因组SNP系统发育树、hierBAPS(hierarchical Bayesian Analysis of Population Structure)划分遗传谱系、Bandage解析bla_CTX-M所在质粒Inc类型。纳入公开人源ESBL-Ec基因组(n=126)及同村人源碳青霉烯酶产酶大肠埃希菌(CREC, carbapenemase-producing E. coli)分离株(n=17)进行系统进化比较。

研究结果

ESBL-Ec was widespread among rural backyard animals（庭院散养动物中广泛存在ESBL-Ec）

共采集1044份样本，总ESBL-Ec阳性率为44.7%(467/1044)。各物种阳性率分别为猪78.7%(328/417)、鸡11.5%(35/305)、牛61.5%(8/13)、羊50.0%(5/10)、鸭28.6%(2/7)、狗14.1%(13/92)、猫5.3%(1/19)；180份苍蝇样本中分离出74株ESBL-Ec(41.1%)。地理分布显示猪和鸡中ESBL-Ec在所有调查村庄均有检出。表明ESBL-Ec在庭院多物种动物及伴生昆虫中广泛定植。

Prolonged pig-rearing duration contributes to ESBL-Ec carriage in backyard pigs（延长养猪年限是庭院猪只ESBL-Ec定植的危险因素）

对254户养猪家庭问卷调查的单因素分析筛选出养猪时长、住户平均年龄、猪饮用水源、猪圈清洗水源、是否养鸡和养猫6个变量(P<0.20)进入多因素logistic回归。最终仅"养猪时长"具显著统计学意义(P=0.007)，养猪历史越久，猪群ESBL-Ec定植优势比越高(OR=1.2, 95% CI: 1.0–1.3)，提示长期连续养殖促进ESBL-Ec在猪群中的持留与富集。

High antimicrobial resistance rates observed in pig ESBL-Ec from backyard farms（庭院猪源ESBL-Ec呈现高水平抗菌药物耐药表型）

467株ESBL-Ec对头孢噻肟(cefotaxime)耐药率100.0%、四环素(tetracycline)95.9%、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)92.7%；23.8%(111/467)对多黏菌素(colistin)耐药（猪源87株），全部菌株对美罗培南(meropenem)和替加环素(tigecycline)敏感，阿米卡星(amikacin)及哌拉西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)耐药率低（分别5.1%、2.6%）。猪源分离株对庆大霉素、呋喃妥因、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、磷霉素(fosfomycin)、多黏菌素及阿莫西林-克拉维酸耐药率显著高于其他动物来源分离株。说明猪源ESBL-Ec呈现较严重的多重耐药，而其他动物组间耐药谱较接近。

Genetic diversity prevails in backyard animal ESBL-Ec with few clonal spreads（庭院动物ESBL-Ec总体遗传多样但存在少量克隆传播）

243株WGS分析显示83.5%属系统发育群A(phylogroup A)，其余为B1、D、E、C。MLST鉴定出108个已知ST及15个新型ST，优势ST为ST10(n=37)、ST48(n=16)、ST206(n=14)、ST744(n=10)，合计占31.7%，且ST10和ST48含多物种来源分离株。hierBAPS划分7个谱系(L1–L7)，每一谱系均混杂至少两种宿主来源分离株，核心基因组SNP进化树中不同宿主分离株随机分布，体现整体遗传多样性。但同时发现不同村庄/同村不同户甚至同户猪源分离株间SNP差异极小（0–65 SNPs），同户不同动物（鸡与狗）、跨村不同动物来源分离株亦存在0–33 SNPs的高度相似簇，证实存在同一克隆在不同宿主及空间范围的局部传播。

The widespread distribution of bla_CTX-Min different animal hosts and bacterial plasmids（bla_CTX-M基因广泛分布于不同动物宿主及质粒）

97.9%(238/243)携带bla_CTX-M基因，分属CTX-M-9群(67.8%)和CTX-M-1群(32.2%)，检出11种亚型，最常见为bla_CTX-M-14(33.5%)、bla_CTX-M-65(24.3%)、bla_CTX-M-55(21.3%)，三者占79.1%。通过组装图预测85.4%的bla_CTX-M位于可移动质粒，主要质粒不相容(incompatibility, Inc)类型为IncFIB(25.5%)、IncHI2(11.3%)、IncFII(10.5%)、IncX1(7.9%)；同一bla_CTX-M亚型可定位于多种Inc型质粒，同一Inc型质粒亦可携带不同bla_CTX-M基因。遗传相近但不同宿主分离株可共享相同bla_CTX-M-质粒组合，或在同一遗传簇内携带不同bla_CTX-M背景，提示水平基因转移(horizontal gene transfer)活跃。

Antimicrobial resistance (AMR) and virulence genes among ESBL-Ec from various animals（不同动物来源ESBL-Ec携带AMR基因及毒力基因情况）

除bla_CTX-M外，常见AMR基因包括氨基糖苷类(aac/aad/aph家族)、磺胺类(sul1/2/3)、甲氧苄啶(dfrA12/14/17)、喹诺酮(oqxAB, qnrS1)、四环素[tet(A)]、磷霉素[fosA3]、氟苯尼考[floR]基因；mcr-1基因检出率83/467(17.8%)，猪源最高(23.5%)。猪和苍蝇分离株平均AMR基因数(13.4–15.3个)显著高于非猪偶蹄动物(8.4个,P<0.01)；各宿主来源毒力相关基因数目无显著差异。部分AMR基因共存形成共选择网络。

Genetic associations between backyard animal and human isolates（庭院动物与人源分离株的遗传学关联）

将动物源ESBL-Ec与126株中国公开人源ESBL-Ec及同村17株人源CREC构建核心基因组SNP进化树，人源分离株散布于动物源分离株之中，hierBAPS各谱系均混合人与动物分离株；部分人源与动物源分离株SNP差异仅2–70个（最低为一株本村人源与鸡源相差14 SNPs）。主成分判别分析(DAPC)显示人与动物分离株基因组高度重叠，支持潜在跨宿主传播及本地循环。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究庭院动物ESBL-Ec检出率（猪78.7%、牛61.5%、羊50.0%）高于非洲国家报道及国内部分商品化猪场数据，家禽检出率(11.5%–28.6%)与其他亚洲国家相当或偏低，反映地域与管理模式差异。高流行率可能与农户抗菌药物知识缺乏（70.5%）、无兽医指导购药（近半数）、复用剩药(31%)、卫生条件差、使用未经处理井水/河水及苍蝇媒介传播有关——同一地区既往研究显示河水ESBL-Ec阳性率64%，且该环境分离株与动物共享ST10及bla_{CTX-M-14/55/65}，佐证环境—动物—人生态联系。bla_{CTX-M-14/55/65}为主型与中国牲畜及人源流行谱一致，但bla_CTX-M-65在庭院较高(24.3%)而bla_CTX-M-15较低(7.5%)，暗示庭院与商品化农场因用药及选择压力不同致耐药基因谱差异。系统进化证实动物—人—环境分离株遗传亲缘关系密切，提示庭院养殖生态系统可能存在ESBL-Ec局部循环及向人群外溢(spillover)风险。研究局限性包括2015年采用琼脂稀释法测多黏菌素（现推荐微量肉汤稀释法）及人源比对数据主要为全国公开库而非完全匹配区域数据，但通过同村CREC比对部分弥补。

结论（翻译）： 产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBL-Ec)在中国农村庭院散养动物中广泛分布，且与人和环境分离株共享遗传特征，提示潜在局部循环。这些发现表明动物、环境与人间存在可能的传播途径，虽需进一步研究确认传播动力学，但强化抗菌药物管理(antimicrobial stewardship)、改善养殖场管理和加强环境卫生对于遏制ESBL-Ec传播、保护公共卫生至关重要。