靶向B7同源物3(B7-H3)的嵌合抗原受体T细胞分泌表皮生长因子受体双特异性T细胞衔接器以改善胶质母细胞瘤进展的控制

《Molecular Biomedicine》：B7 homolog 3-targeted CAR-T cells secreting EGFR T-cell engagers for improved control of glioblastoma progression

　　

摘要：胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，虽然嵌合抗原受体T(Chimeric Antigen Receptor-T, CAR-T)细胞疗法展现出前景，但其疗效仍受限于抗原异质性与免疫逃逸。研究人员检测了B7同源物3(B7 Homolog 3, B7-H3)、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)及白细胞介素13受体α2(Interleukin-13 Receptor Subunit Alpha 2, IL-13RA2)在GBM组织及细胞系中的表达。尽管三种抗原均高表达，但持续暴露于B7-H3 CAR-T细胞可导致显著的B7-H3下调及伴随的EGFR上调，揭示了一种潜在的免疫逃逸机制。为解决此异质性问题，研究人员工程化改造T细胞使其表达抗B7-H3 CAR并分泌EGFR靶向双特异性T细胞衔接器(EGFR-targeting Bispecific T-cell Engager, EGFR-BsTe)。这些B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞发挥双重功能：直接的B7-H3依赖性细胞毒性，以及通过分泌的EGFR-BsTe募集未修饰T细胞清除EGFR阳性肿瘤细胞。值得注意的是，EGFR-BsTe的分泌促进了CAR-T细胞的增殖与效应分化。在原位GBM异种移植模型中（包括含异质性抗原表达混合肿瘤的模型），B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞较传统B7-H3 CAR-T细胞表现出更优的抗肿瘤活性并延长生存。定量分析显示EGFR-BsTe分泌以靶细胞依赖的方式消除EGFR上调并促进B7-H3下调；然而当大部分肿瘤细胞缺失CAR靶点(B7-H3)时疗效降低。研究结果表明，用EGFR靶向双特异性衔接器武装B7-H3 CAR-T细胞是克服抗原异质性、改善GBM患者治疗前景的有前景策略。

论文解读：

本研究发表于《Molecular Biomedicine》。胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM；WHO Ⅳ级)是最常见的成人原发性恶性脑肿瘤，中位总生存期不足15–24个月，标准治疗（最大安全切除+放疗+替唑胺化疗）无法治愈，复发几乎不可避免。嵌合抗原受体T(Chimeric Antigen Receptor-T, CAR-T)细胞疗法在血液肿瘤中成效显著，但在实体瘤如GBM中受限于免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)、固有的抗原异质性及靶抗原下调导致的免疫逃逸。临床前及临床研究显示，靶向IL-13RA2或EGFRvⅢ的CAR-T治疗后可出现靶抗原丢失造成的获得性耐药。B7同源物3(B7 Homolog 3, B7-H3/CD276)在GBM上差异高表达而正常重要组织低表达，是具吸引力的泛癌免疫治疗靶点，但持续CAR-T压力也可诱导B7-H3丢失导致复发。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)在>50% GBM中扩增/突变，是经典靶点，但全身给药的双特异性T细胞衔接器(Bispecific T-cell Engager, BsTe/BiTE)存在靶外毒性(on-target off-tumor toxicity)风险，且单靶点靶向易因异质性及代偿性通路激活产生耐药。目前尚无同时靶向B7-H3与EGFR治疗GBM的研究报道。为此，研究人员构建可同时表达抗B7-H3 CAR并局部分泌EGFR/CD3双特异性T细胞衔接器(EGFR-BsTe)的二代CAR-T细胞(B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe)，旨在克服单一靶点抗原丢失与异质性逃逸，并通过原位异种移植模型及患者来源类器官验证其疗效与机制。

主要关键技术方法：从健康供者或患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)富集T细胞，用慢病毒转导第二代CAR构建物（含CD8_α跨膜区、4-1BB共刺激域及CD3ζ信号域，B7-H3纳米抗体或抗CD19 scFv对照；EGFR-BsTe或CD19-BsTe序列带Igκ信号肽及His-tag由同一载体EF-1α启动子驱动分泌）；用CRISPR/Cas9(lentiCRISPRv2)构建B7-H3或EGFR基因敲除(knockout, ko)GBM细胞系(GBM06-B7-H3^ko、GBM06-EGFR^ko)及荧光素酶标记细胞；建立患者来源GBM类器官(Glioblastoma Organoids, GBOs)；建立NSG小鼠原位颅内GBM06-luc异种移植及混合肿瘤(GBM06+GBM06-B7-H3^ko或GBM06+GBM06-EGFR^ko)模型，尾静脉或经指定途径给予CAR-T细胞治疗，活体生物发光成像(Bioluminescence Imaging, BLI)监测肿瘤及Kaplan-Meier法评估生存；通过流式细胞术、Western blot、ELISA、免疫组化(IHC)/多重免疫组化(mIHC)、实时细胞分析(Real-Time Cell Analysis, RTCA)及xCELLigence阻抗杀伤实验进行体外体内功能评价。

研究结果：

Persistent B7-H3 CAR-T cell pressure reduces B7-H3 expression but upregulates EGFR in GBM cells（持续B7-H3 CAR-T细胞压力使GBM细胞B7-H3下调但EGFR上调）：研究人员通过流式细胞术证实B7-H3、EGFR及IL-13RA2在4株GBM细胞系、2例原代GBM培养物及2例患者来源类器官表面均稳定高表达。将GBM细胞与B7-H3 CAR-T细胞共孵育3天后，存活残留细胞中B7-H3膜表达显著降低、EGFR上调、IL-13RA2维持不变；原位GBM06异种移植小鼠经B7-H3 CAR-T处理后，肿瘤组织也显示B7-H3下调及EGFR升高。表明持续B7-H3 CAR-T选择压可筛选出具B7-H3丢失伴EGFR上调的逃逸变异克隆，支持双靶点联合策略。

High co-expression of B7-H3 and EGFR correlates with poor prognosis in GBM patients（B7-H3与EGFR高共表达与GBM患者不良预后相关）：基于GTEx、CGGA数据库分析及GEPIA共表达分析显示B7-H3在各级别胶质瘤高表达，EGFR在GBM(Ⅳ级)特异性高表达且二者在胶质瘤标本中显著正相关。Kaplan-Meier生存分析示B7-H3或EGFR高表达患者总生存期(Overall Survival, OS)及无病生存期(Disease-Free Survival, DFS)均显著差于低表达者；4例新鲜GBM手术标本IHC证实B7-H3与EGFR蛋白均强阳性共表达，且原发肿瘤内T细胞浸润极少。为双靶点工程化T细胞治疗提供临床合理性依据。

Development and characteristics of B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe Cells, which secrete EGFR-BsTe to enhance proliferation and differentiation activation（分泌EGFR-BsTe以增强增殖与分化活化的B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞的开发与特性）：研究人员设计慢病毒载体使T细胞表达B7-H3 CAR并分泌EGFR-BsTe（对照含CD19-BsTe分泌B7-H3 CAR-T或仅分泌EGFR-BsTe的CD19 CAR-T）。流式确认CAR表达率约50%，Western blot在培养上清检出约55 kDa分泌BsTe。反复与GBM06细胞共刺激实验中，B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞较B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe显示更好扩增能力（第3次及以后刺激轮次差异明显），效应记忆(Effector Memory, T_EM)及效应T细胞比例更高，耗竭标志物(TIM-3、PD-1、LAG-3)呈降低趋势，且保有相当杀伤活性。说明局部EGFR-BsTe分泌可促进CAR-T增殖、持久性及向效应表型分化。

B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe cells exhibited better cytotoxic function against GBM cells in vitro（B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞在体外对GBM细胞具更优细胞毒功能）：在不同E:T比下，B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe与B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe对野生型GBM细胞B7-H3依赖性杀伤相当，但前者上清中穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)、TNF-α及IFN-γ显著升高。收集含EGFR-BsTe的上清加入旁观者T细胞可特异性杀伤GBM细胞（被GBM06-EGFR^ko取消），证实BsTe生物活性。实时阻抗杀伤显示B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe更快清除靶细胞，该优势在B7-H3或EGFR单敲除细胞中被消除，表明抗原特异性。与GBM患者来源类器官共培养后，B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞更多定位于类器官周边并浸润其内部（CD3免疫荧光），显示更强原位杀伤与浸润能力。

B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe cells is efficacious against GBM in mice（B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞在小鼠体内对GBM有效）：NSG小鼠颅内接种GBM06-Luc后经尾静脉给予两剂CAR-T。B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe组肿瘤负荷(BLI信号)显著低于对照组，中位生存期显著延长，体重无明显毒性波动。取材H&E及IHC示UTD或CD19-CAR-T-EGFR-BsTe组为大片占位性肿瘤；B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe组中度抑制；B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe组肿瘤最小。IHC定量显示B7-H3-CAR-T各组肿瘤B7-H3下调，而仅B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe组出现EGFR上调——此现象在B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe组被消除；CD3⁺T细胞浸润以B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe组最丰富。表明局部EGFR-BsTe分泌防止EGFR代偿性上调并增强瘤内T细胞招募。

B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe cells locally release EGFR-BsTe and enhance intratumor CAR-T cell infiltration in vivo（B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞局部释放EGFR-BsTe并增强瘤内CAR-T细胞浸润）：ELISA检测发现仅B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe治疗组肿瘤组织中可检测到高水平EGFR-BsTe（归一化为pg/mg蛋白），正常脏器极低；同法CD19-BsTe仅在B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe组肿瘤检出。IHC示人CD3⁺T细胞大量浸润B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe治疗组肿瘤，脾脏也有人T细胞，其他组瘤内极少。证实CAR识别肿瘤驱动局部BsTe产生及T细胞聚集。

B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe cells are efficacious against heterogenous tumors（B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe细胞对异质性肿瘤有效）：在GBM06+GBM06-B7-H3^ko(1:1)混合模型中，两种B7-H3 CAR-T均抑制生长但彼此无显著差异，因部分细胞缺B7-H3使CAR激活及BsTe局部产量不足，EGFR亦无显著上调（无选择压）。在GBM06+GBM06-EGFR^ko(1:1)混合模型中，B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe较B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe显著更优抑制肿瘤并延长生存；IHC示B7-H3下调更明显且B7-H3-CAR-T-CD19-BsTe组特征性EGFR上调被BsTe分泌完全消除。说明EGFR-BsTe的附加获益依赖于CAR靶(B7-H3)存在以驱动局部BsTe生产，进而清除EGFR阳性逃逸克隆。

讨论与结论翻译总结：研究人员指出抗原调节（丢失/上调）是CAR-T治疗后重要耐药机制，本研究首次报道用单载体共表达B7-H3 CAR与分泌型EGFR-BsTe的"CAR-T细胞分泌BsTe(CAR-T cell secreting BsTe/TEAM approach)"策略克服GBM中B7-H3丢失与EGFR代偿上调双重逃逸。局部BsTe分泌限定于TME，规避全身BsTe疗法的靶外毒性。EGFR-BsTe分泌还形成CAR-T激活→局部BsTe生成→募集旁观T细胞及增强CAR-T自身效应→进一步扩增的正反馈循环。混合模型表明当CAR靶(B7-H3)在大比例肿瘤细胞缺失时效能受限，提示未来或可探索三靶点或多组学抗原谱分层。局限含KO模型不能完全模拟自然异质性、NSG鼠缺完整免疫系统无法评估长期免疫记忆、鼠EGFR不与抗人EGFR scFv交叉反应故未能在本鼠模中直接测系统毒性。结论：工程化B7-H3 CAR-T细胞局部分泌EGFR靶向双特异性T细胞衔接器(B7-H3-CAR-T-EGFR-BsTe)通过直接CAR介导杀伤加BsTe募集未修饰T细胞清除EGFR阳性细胞，在原位及异质性GBM模型中优于传统B7-H3 CAR-T，能抑制EGFR代偿性上调、促进CAR-T增殖与瘤内浸润、延长生存，为克服GBM抗原异质性及改善过继T细胞治疗提供了具转化潜力的策略。