D2蛋白DE环中240Ala:Glu:Glu:Thr243序列对光系统II受体侧的贡献

《Photosynthesis Research》：The contribution of the 240Ala:Glu:Glu:Thr243 sequence in the DE-loop of D2 to the acceptor side of Photosystem II

　　

光系统II（PS II）的D2蛋白具有五条跨膜螺旋（A-E）。连接D螺旋和E螺旋的延伸环（loop）参与了初级质体醌电子受体Q_A的结合环境构成，以及Q_A与次级质体醌电子受体Q_B之间非血红素铁（NHI）上结合的重碳酸根（bicarbonate）的结合环境构成。Ala²⁴⁰至Thr²⁴³残基位于保守序列²⁴⁰AEETYSMVTAN²⁵⁰内，该序列有助于Q_A和重碳酸根的稳定。研究人员构建了A240D、E241A、E242A、E242D和T243A突变体以研究这些残基的功能。A240D和E241A突变株中的突变对PS II性能影响较小， except 在单次翻转光化闪光后，甲酸盐（formate）的加入改变了E241A突变体的叶绿素a荧光衰减。可变叶绿素a荧光和热致发光（thermoluminescence, TL）测量显示，E242A和E242D突变体的受体侧电子传递受损，这与Q_A与Q_B之间氧化还原电位差降低一致。此外，T243A突变体表现出更高的光损伤易感性。这些数据表明，在D2的Glu²⁴¹–Thr²⁴³之间引入突变会损害PS II活性，但其有害程度小于在Q_B结合位点附近的D1蛋白相应位置Glu²⁴³–Thr²⁴⁵残基处引入的突变。

该研究发表于《Photosynthesis Research》，聚焦于光系统II（PS II）中D2蛋白DE环保守序列²⁴⁰AEET²⁴³的功能解析。PS II是催化水光解和质体醌还原的类囊体膜蛋白复合体，在蓝细菌、藻类和植物中保守存在。本研究采用的模式生物为集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。PS II核心由D1和D2蛋白构成，周围环绕CP47和CP43等叶绿素a结合亚基。D1和D2蛋白的DE环均参与Q_A结合环境、Q_B结合环境以及非血红素铁（NHI）上重碳酸根配位的调控。先前研究表明，D1蛋白的²⁴²EEETYNIVAAH²⁵²序列和D2蛋白的²⁴⁰AEETYSMVTAN²⁵⁰序列围绕NHI环境，其中D1-Tyr²⁴⁶和D2-Tyr²⁴⁴为重碳酸根提供氢键。D1-Glu²⁴⁴突变严重损害Q_A^?向Q_B的电子传递，而D2-Tyr²⁴⁴突变则破坏PS II组装。鉴于D1和D2蛋白在重碳酸根结合基序中或其附近残基的多样化作用，研究人员开展了本项研究，以探究D2蛋白保守区域Ala²⁴⁰至Thr²⁴³对PS II稳定性和活性的贡献。

本研究利用的野生型菌株为集胞藻6803 GT-O1株。研究人员通过快速定点突变技术构建了A240D、E241A、E242A、E242D和T243A五种突变体，将突变引入含psbDI:psbC操纵子的质粒，再转化至psbDI:psbC操纵子及psbDII基因已敲除的集胞藻6803菌株中，通过壮观霉素抗性筛选、菌落PCR和Sanger测序确认突变存在及分离纯化。主要技术方法包括：氧释放测定（采用Clark型氧电极，分别用DCBQ、DMBQ作为PS II特异性人工电子受体，或用碳酸氢钠进行全链氧释放测定）、光损伤与恢复实验（高光强2000 μmol photons m^?2 s^?1处理45分钟后转至低光强30 μmol photons m^?2 s^?1恢复135分钟，部分实验加入林可霉素抑制蛋白质合成）、可变叶绿素a荧光诱导与衰减动力学测定（使用FL-3500荧光仪，通过单周转或三周转光化闪光，在有无DCMU条件下检测）、低温（77 K）荧光发射光谱（采用改良MPF-3 to荧光光谱仪，440 nm或580 nm激发）、热致发光（TL）测量（单闪激发后?40°C至80°C升温记录B带、Q带和C带）、蓝_native聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）及蛋白质免疫印迹（检测D1、D2、CP47、CP43蛋白）、以及³⁵S-甲硫氨酸蛋白质标记（高光处理后追踪PS II修复过程中蛋白质合成动态）。

研究结果显示，所有突变株的光合自养生长及PS II单体和二聚体积累与对照株相似，但E241A、E242A、E242D和T243A突变体中未结合的CP47增加，除E242A外各突变体未结合的CP43均增加，其中T243A株增加最为显著。关于Ala²⁴⁰和Glu²⁴¹位点的作用，A240D和E241A突变体的全链氧释放速率与对照相近，但A240D突变体使用DMBQ时氧释放速率约为对照的70%、使用DCBQ时约为92%，提示DMBQ结合受到影响；E241A突变体则对两种人工电子受体均表现正常。高光胁迫下，两突变体与对照的氧衰退及恢复模式相似。可变叶绿素a荧光诱导显示，无DCMU时E241A突变体峰值荧光产率降低；有DCMU时两突变体最大荧光水平与对照相似，表明活性PS II中心数量相近。低温荧光光谱亦支持此结论。单次闪光后叶绿素a荧光衰减的快速组分在两突变体中略有减慢（对照t_1/2 270 μs，A240D为316 μs，E241A为322 μs）；三闪后中间相显著减慢（对照t_1/2 3.0 ms，A240D为7.0 ms，E241A为8.2 ms）。甲酸盐实验表明，对照细胞呈现轻微的重碳酸根可逆性甲酸盐效应，A240D细胞对甲酸盐和重碳酸根添加相对不敏感，而E241A突变体的荧光衰减受甲酸盐减慢且可被重碳酸根恢复。

关于Glu²⁴²和Thr²⁴³位点的作用，E242A、E242D、T243A突变体的全链氧释放速率与对照相近（>92%），但使用PS II特异性电子受体时有所下降：E242A在DMBQ和DCBQ下分别为对照的76%和85%；E242D分别为67%和87%；T243A分别为83%和60%。高光胁迫实验中，E242A与对照类似；E242D对高光更敏感，氧释放降至初始的约40%（对照约60%），但低光下可恢复至约90%；T243A突变体在高光下完全丧失氧释放能力，恢复亦较对照缓慢。值得注意的是，全链电子传递速率得以维持，表明足够PS II中心仍存在。为探究T243A恢复延迟的原因，研究人员使用³⁵S-甲硫氨酸标记追踪修复过程，发现T243A突变体在恢复期掺入更多标记，提示其修复速率更高。可变叶绿素a荧光诱导显示，无DCMU时E242A、E242D和T243A突变体J水平升高，指示Q_A^?氧化减慢；有DCMU时各株Fm相似，表明活性中心数量相近，但E242D最大荧光水平升高，提示更多PS II处于状态1。荧光衰减分析表明，三突变体快速组分均减慢（对照t_1/2 270 μs，E242A 346 μs，E242D 377 μs，T243A 412 μs）；E242A中间相较慢（t_1/2 7.0 ms），慢相较快（t_1/2 2.0 s）；T243A慢相振幅增至16%。三闪后E242A中间相仍较慢，E242D和T243A与单次闪光结果相似。甲酸盐实验中，E242A几乎不受影响；E242D和T243A受甲酸盐减慢，且E242D可被重碳酸根恢复，T243A部分恢复。热致发光结果显示，E242A突变体B带温度较对照降低约4°C，E242D B带温度与对照相似；有DCMU时两突变体Q带均升至约23°C；E242A、E242D的C带振幅降低。T243A突变体B带温度与对照相似，Q带略升至21°C。

讨论部分，研究人员首先指出靶向D2蛋白DE环保守Ala²⁴⁰–Asn²⁵⁰区域的突变未破坏PS II组装或阻止光合自养生长。该区域的重碳酸根辅因子作为NHI的双齿配体，由D1和D2蛋白的DE环共同稳定。与此前D2-Met²⁴⁶和D2-Asn²⁵⁰突变体损害PS II活性不同，本研究所有突变体均能光合自养生长并组装PS II，仅T243A株有未组装CP43累积。

研究人员进一步比较了D2蛋白²⁴¹EETY²⁴⁴基序与D1蛋白²⁴³EETY²⁴⁶基序的相对重要性。D1-Glu²⁴⁴突变导致Q_B结合减弱、光合自养生长受损，而D2-Glu²⁴²突变损害较轻。E242A突变体荧光衰减毫秒组分增加约三倍，慢相加快，三闪后损害程度不变，稳态下J水平升高、氧释放降低。E242D突变体略严重，但荧光衰减快速组分更接近对照，TL B带未偏移。这与D1-E244A突变体表现不同，后者Q_A/Q_A^?氧化还原电位正移且耐高光性增强，而D2-E242A和E242D对高光敏感性与对照相似。基于CAVER程序鉴定的两条通道（Channel A和Channel B），D1-Glu²⁴⁴位于Channel A内，与水分子A506形成氢键；而水分子D572桥连D2-Glu²⁴²与D2-Glu²⁴¹主链碳基（通过水分子D581）。分子动力学模拟表明D1-Glu²⁴⁴和D2-Glu²⁴²均与D2-Lys²⁶⁴形成三重盐桥，水分子D564桥连D2-Glu²⁴²与D2-Lys²⁶⁴，影响通道开放构象。由于D2-Lys²⁶⁴与重碳酸根形成氢键，D2-Glu²⁴²与D2-Lys²⁶⁴相互作用的改变可能影响重碳酸根与NHI配位的稳定性。研究人员推测，D1-E244A突变体中电子传递受损更严重可能源于重碳酸根结合和Q_B结合均降低。甲酸盐和重碳酸根添加实验显示，E242A对两者不敏感，类似于D1-E244A；而E242D的甲酸盐效应可被重碳酸根恢复，提示保留的负电荷（及与D2-Lys²⁶⁴的相互作用）对NHI的可及性至关重要。两通道在重碳酸根附近汇合可能解释此现象。与D1-E244A不同，E242D对高光诱导的光损伤更敏感。

关于Ala²⁴⁰和Glu²⁴¹的相对重要性，既往D1-E243K和D1-E242Q突变体表现类似野生型。D1-?EEE^242?4三重谷氨酸缺失及Gln²⁴¹→His²⁴¹相关突变体则光合自养生长受损、氧释放降低。D2-A240D突变体类似对照细胞，但对甲酸盐和重碳酸根添加相对不敏感；D2-E241A突变体则保留了对甲酸盐的敏感性。两突变体在DCMU存在下可变荧光上升减慢，可能反映DCMU结合改变。研究人员讨论了D2-Glu²⁴¹在PS II生物发生中的潜在作用：在嗜热聚球藻（Thermosynechococcus vestitus）和Thermostichus vulcanus的RC47前组装复合物中，D2-Glu²⁴¹而非重碳酸根作为NHI的单齿配体，此构象存在于Psb28装配因子存在时；在远红光生长的聚球藻（Synechococcus sp. PCC 7335）无Psb28的apo-PSII复合物中也观察到类似现象。但本研究D2-E241A突变体表现类似对照细胞，此前衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）D2-E241Q突变体亦然，提示该相互作用可能在特定环境条件下更为重要，如防止氧气结合NHI产生光驱动O₂^?，或协助防止重碳酸根过早结合。

关于D2-Thr²⁴³与D1-Arg²⁶⁹的对称性相互作用及其对光损伤易感性的影响，D2-Thr²⁴³羟基与D1-Arg²⁶⁹的Nε氮相应，D1-Thr²⁴⁵羟基与D2-Arg²⁶⁵的Nη氮形成盐桥或氢键。D2-Arg²⁶⁵又与NHI配体D2-His²⁶⁸相互作用，D1-Arg²⁶⁹与D1-His²⁷²相互作用。此前研究表明D2-Arg²⁶⁵突变体对光损伤高度敏感。T243A是本研究最受损的突变体：无DCMU时更多中心发生与OEC的S2态的逆向反应；对甲酸盐最敏感；对高光诱导光损伤最敏感。鉴于衣藻中D1-Arg²⁶⁹→Gly突变破坏OEC组装和正向电子传递，研究人员认为T243A的有害表型源于D2-Thr²⁴³:D1-Arg²⁶⁹相互作用的破坏，进而扰动D1-His²⁷²对NHI的配位。但D1-Thr²⁴⁵与相应D2-Thr²⁴³的相对重要性尚不确定，因尚无D1-Thr²⁴⁵突变报道。