抗生素暴露及持留菌(persister)状态的恢复影响铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)毒力表型

《Archives of Microbiology》：Antibiotic exposure and recovery of persister states influence virulence phenotypes in Pseudomonas aeruginosa

　　

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa)的致病性不仅由其耐药机制介导，也与其形成持留细胞(persister cells，休眠、非生长或慢生长状态，可在高浓度杀菌性抗生素下存活，撤除压力后恢复生长)的能力有关。本研究体外考察了P. aeruginosa PA14经30倍最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC；亚胺培南60 μg/mL或环丙沙星3.75 μg/mL)处理后，持留菌的毒力表型及应激诱导调控。采用双相杀伤实验(biphasic killing assay)，检测到亚胺培南和环丙沙星处理24 h后持留菌存活水平分别为4.8和3.4 log10CFU/mL；MIC测定证实无获得性耐药。流式细胞术显示随时间积累具中等氧化还原活性和膜完整性的细胞，符合持留表型。浮游菌(planktonic)及生物膜(biofilm)相关群体均含持留菌，且生物膜含更多耐受细胞。此外，持留菌产色素(pigment production)、生物膜形成及吞噬存活能力降低。基因表达分析显示持留菌中higB和pqsA上调，复苏细胞(recovered cells)呈不同表达谱。过氧化氢(H2O2；0.4%)预暴露使抗生素处理后存活率提高>1 log10；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU；256 μg/mL)预处理使亚胺培南持留性提高2倍。综上，氧化及基因毒性应激促进持留形成，巨噬细胞相互作用调节持留菌生理，为宿主—病原体动力学及潜在治疗途径提供新见解。

论文解读：抗生素暴露及持留菌(persister)状态恢复对铜绿假单胞菌毒力表型的影响

研究背景与立题依据

细菌持留细胞(persister cells)是指菌群中经随机表型切换进入可逆性休眠或非生长、代谢低活性状态的一小部分亚群，能在远高于MIC的杀菌性抗生素浓度下存活，撤除压力后可恢复分裂生长，但不发生耐药基因突变（即非遗传性耐药）。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床重要的革兰氏阴性机会致病菌，易引起难治性院内感染（如呼吸机相关性肺炎、烧伤及慢性伤口感染、囊性纤维化肺感染），其致病性与广谱固有耐药、生物膜形成及群体感应(Quorum Sensing，QS)调控的毒力因子（绿脓菌素pyocyanin、绿脓铁载体pyoverdine、吡咯菌素pyorubin等）密切相关。已有研究证实P. aeruginosa可形成持留菌，且在囊性纤维化患者气道分离株中检出率高，与感染复发和慢性化关系密切。然而，目前对P. aeruginosa持留菌本身及其复苏后(recovered cells)的毒力潜能、与宿主免疫细胞（如巨噬细胞）互作后的表型变化，以及不同类别抗生素（β-内酰胺类vs氟喹诺酮类）诱导持留菌的生理差异仍知之甚少。为此，研究人员开展本研究，旨在体外表征P. aeruginosa经亚胺培南(imipenem，β-内酰胺类，抑制肽聚糖合成)和环丙沙星(ciprofloxacin，氟喹诺酮类，抑制DNA促旋酶/拓扑异构酶IV)诱导产生的持留菌及复苏细胞的毒力表型、基因表达特征，并探讨氧化应激、DNA损伤及巨噬细胞吞噬对持留形成与存活的影响。

主要关键技术方法概述

研究人员选用P. aeruginosa参考株PA14及两株临床分离株（12-0048取自支气管肺泡灌洗液、16-0040取自气管吸出物），采用肉汤微量稀释法测定MIC；以30×MIC亚胺培南(60 μg/mL)或环丙沙星(3.75 μg/mL)处理稳定期过夜培养菌，进行双相杀伤曲线测定持留菌存活数；采用REPTIS(Replica Plating Tolerance Isolation System)法在固体平板上验证持留表型；复苏实验将抗生素处理后的持留菌洗涤后转入无药LB培养24 h；采用流式细胞术(BacLight? RedoxSensor? Green Vitality Kit + 碘化丙啶Propidium Iodide，PI)检测细胞活力与氧化还原状态；qRT-PCR检测持留及复苏细胞中SOS反应(recA)、毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin，TA)系统(higB)、严谨反应(stringent response；relA、spoT、lon)及毒力相关QS基因(pqsA、pvdS)的相对表达；静态生物膜模型分别收集浮游菌与生物膜附着菌测定持留水平；分光光度法测定三种色素(pyoverdine、pyocyanin、pyorubin)产量；结晶紫法测生物膜生物量，刚果红(Congo Red)结合法评估胞外基质；H₂O₂(0.4%)预处理及5-氟尿嘧啶(5-FU；256 μg/mL)预处理评估氧化应激与DNA损伤对持留形成的促进效应；以AMJ2-c11小鼠肺泡巨噬细胞系进行体外吞噬实验，评价持留菌经吞噬后再暴露于抗生素的存活情况。所有实验重复≥3次生物学独立重复。

研究结果

Antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa

PA14及两临床分离株对亚胺培南MIC为2–4 μg/mL，对环丙沙星MIC为0.125–1 μg/mL，均在CLSI敏感或中介范围内，无天然高水平耐药。

Persister cells are detected at 30 × MIC of imipenem and ciprofloxacin

经不同倍数MIC(1、3、10、30、100×)处理4 h筛选，确定30×MIC可使大部分敏感菌被杀而持留菌可被检出。REPTIS法显示在含抗生素"主平板"上无生长，"复制平板"(无抗生素)上有菌落长出，确认典型持留行为——亚胺培南非持留复苏菌落呈典型绿色色素，环丙沙星处理组复苏菌落呈棕褐色。双相杀伤曲线显示：亚胺培南组初始快速杀灭后(前4 h)平台期存活约4.8 log₁₀CFU/mL(24 h)；环丙沙星组前2 h剧降至约4.4 log₁₀CFU/mL后进入平台期，24 h存活约3.4 log₁₀CFU/mL，符合典型持留菌双相死亡特征。

Revival and antibiotic susceptibility confirm the persister phenotype

持留菌洗涤转无药LB后可再生长期长——亚胺培南持留菌滞后期约4 h，环丙沙星持留菌滞后期约1 h(接近对照)。复苏细胞及其子代的MIC与亲本野生株一致，证实存活并非因获得性耐药而是表型持留。

Persistence in adhered and non-adhered cells

静态生物膜模型中，生物膜附着细胞比浮游细胞含更高比例持留菌：亚胺培南处理浮游菌存活0.8%、生物膜存活2.04%；环丙沙星处理浮游菌存活2.4×10^-6%、生物膜存活0.007%。两临床分离株亦呈相似趋势(环丙沙星中介株16-0040仅用亚胺培南测试)。

Cell viability of persister cells by flow cytometry

流式细胞术以低RedoxSensor? Green(RSG)荧光且PI阴性(膜完整但代谢低)界定持留细胞门。随抗生素暴露时间延长(2→8→24 h)，该门内细胞比例逐渐升高，与CFU计数趋势吻合，24 h时亚胺培南组约3.82×10^-4%、环丙沙星组约2.18×10^-5%落入持留门，印证持留菌具中间氧化还原活性和完整膜。

Gene expression analysis in persistent and recovered cells

持留细胞(抗生素暴露8 h)与复苏细胞(无药培养24 h)qRT-PCR结果显示：亚胺培南非持留菌中higB上调48倍，复苏细胞中仍高(35倍)；环丙沙星持留菌higB仅微上调(2.8倍)但复苏细胞中极高(457倍)。recA在环丙沙星处理组(尤其复苏细胞)强诱导，亚胺培南非持留细胞中低。严谨反应基因relA、spoT、lon在持留细胞(8 h)未检出扩增，但在复苏细胞中明显上调，环丙沙星复苏组高于亚胺培南复苏组。pqsA在亚胺培南非持留菌中上调(4.9倍)，在环丙沙星复苏细胞中最高(23.8倍)；pvdS在环丙沙星各组及亚胺培南复苏细胞中上调，亚胺培南非持留菌中也有中度上调。

Exposure to stress conditions enhances antibiotic persistence in P. aeruginosa PA14

亚致死H₂O₂(0.4%，1 h)预暴露使后续亚胺培南和环丙沙星处理的持留菌存活数分别增加>1 log₁₀(亚胺培南由5.9→7.5 log₁₀CFU/mL；环丙沙星由3.8→7.2 log₁₀CFU/mL)，表明氧化应激促进持留形成。亚抑制5-FU(256 μg/mL，4 h)预处理使亚胺培南持留菌存活提高2倍(log₁₀CFU/mL由4.8→6.8)，但对环丙沙星组无显著影响，提示DNA损伤/SOS反应可特异地增强β-内酰胺诱导的持留。

Imipenem- and ciprofloxacin-persistent P. aeruginosa PA14 cells present distinct yet reduced traits associated with virulence / Pigment production

持留菌三种色素(pyoverdine、pyocyanin、pyorubin)产量均显著低于对照；复苏细胞色素产量回升，但环丙沙星复苏细胞pyoverdine和pyocyanin仍低于对照，亚胺培南复苏细胞pyocyanin甚至高于对照。

Biofilm formation analysis

持留菌生物膜形成能力(结晶紫OD_595nm)显著低于对照，复苏细胞有所恢复但未达对照水平。Congo Red结合实验显示持留菌胞外多糖基质产生减少，与生物膜结果一致。

Differential regulation of pqsA and pvdS genes in persistent and recovered cells

如上基因表达部分所述，pqsA和pvdS在持留与复苏阶段呈不同调控模式，暗示不同抗生素应激对QS通路有差异化影响。

Persister cell responses to innate immune challenges reveal differential susceptibility to H₂O₂and phagocytosis

亚胺培南非持留及复苏细胞对H₂O₂敏感性增高(MIC降至0.0098% vs对照0.0391%)，环丙沙星组MIC与亲本相近。吞噬实验显示环丙沙星持留菌被巨噬细胞摄取后CFU几乎无减少(全部被吞噬)，亚胺培南非持留菌有部分逃逸；但总体持留菌毒力相关功能(抗吞噬存活)较野生株减弱。

Phagocytosis reduces persistence in antibiotic-exposed P. aeruginosa

先经巨噬细胞吞噬并杀灭胞外菌后再用30×MIC抗生素处理，存活持留菌比例显著低于未经吞噬的对照(亚胺培南由0.1%→0.03%；环丙沙星由0.0003%→未检出)。已形成的持留菌(先经24 h抗生素处理获持留菌再行吞噬)再遇抗生素则完全被杀灭，提示巨噬细胞内环境破坏持留状态或使其丧失再耐受能力。

讨论与结论总结

本研究满足经典持留细胞判定标准：非复制、高剂量抗生素下存活、双相死亡曲线、撤药后可恢复生长且子代MIC不变、超MIC浓度提高存活比例恒定。使用稳定期菌体控制生长相位影响。生物膜及附着细胞较浮游细胞含更多持留菌，与文献中c-di-GMP升高促休眠一致。持留菌呈低代谢休眠态，色素合成、生物膜形成及抗吞噬能力普遍下调，可能利于能量保存或免疫逃避。氧化应激(H₂O₂)及DNA损伤(5-FU，对亚胺培南特异)可上调持留水平，后者因环丙沙星本身已强烈激活SOS反应故无叠加效应。复苏细胞虽恢复部分毒力表型，但其pqsA/pvdS/higB/recA等基因表达谱不同于原始野生株，说明抗生素应激可"编程"复苏群体具特定转录特征。巨噬细胞吞噬显著降低甚至消除后续持留菌检出，提示胞内免疫微环境不利于持留维持。结论：P. aeruginosa经亚胺培南和环丙沙星暴露可产生典型持留细胞，氧化及基因毒性应激促进其形成；持留菌毒力相关性状整体下调但复苏细胞呈现差异化毒力与基因表达谱；巨噬细胞互作削弱持留能力。该研究首次详细表征了P. aeruginosa持留菌复苏群体的表型及分子特征，拓展了对细菌在抗生素—宿主双重压力下适应策略的认识，为针对持留菌的辅助治疗策略提供了实验依据。本文发表于《Archives of Microbiology》。