基于计算机辅助药物设计优化新型化合物用于治疗心律失常——KCNQ1/KCNE1(IKs)通道激活剂的开发

《British Journal of Pharmacology》：Optimization of novel compounds using computer-aided drug design for treatment of cardiac arrhythmia

　　

背景与目的：电压门控Kv7.1（KCNQ1/KCNE1）通道的功能缺失突变可导致长QT综合征（long QT syndrome, LQTS）等心律失常，其特征为QT间期延长。纠正延长的QT间期的一种策略是设计能激活KCNQ1/KCNE1通道并恢复QT间期的分子，但目前尚无临床批准的KCNQ1/KCNE1激活剂。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）已被证明是KCNQ1/KCNE1的有效激活剂，可增加KCNQ1/KCNE1电流并缩短人心室肌细胞动作电位时程，但PUFAs无选择性且存在多个作用靶点（包括其他心脏离子通道）。实验方法：本研究联合使用配体竞争饱和定位法（Site Identification by Ligand Competitive Saturation, SILCS）与电生理学技术，对结合PUFA结合位点并同时提高效价与位点特异性的化合物进行优化。关键结果：两种化合物——Compound 1-亚油酸（linoleic acid, LIN）缀合物和Compound 2-LIN缀合物，对KCNQ1/KCNE1通道表现出比先前PUFA类似物更强的激活效应，且各自具有截然不同的激活机制。结论与意义：上述发现凸显了计算机辅助药物设计（computer-aided drug design, CADD）在开发更具靶向性与有效性的KCNQ1/KCNE1激活剂方面的潜力，为心律失常个性化治疗策略铺平道路。尽管小分子筛选鉴定出在PUFA结合位点具有有利相互作用的化合物，但其效应需依赖脂质尾部。将脂质尾部引入小分子以靶向膜蛋白跨膜区的策略，可为广泛治疗靶点的药物研发提供新思路。

论文解读：基于计算机辅助药物设计优化KCNQ1/KCNE1激活剂用于治疗心律失常

研究背景与意义

电压门控K⁺通道K_v7.1（由KCNQ1基因编码）与β亚基KCNE1形成复合物，介导心室动作电位复极化期的关键慢延迟整流钾电流（slow delayed rectifier current, IKs）。KCNQ1/KCNE1复合物的功能缺失（loss-of-function）突变是遗传性长QT综合征（long QT syndrome, LQTS, 尤指LQT1型）的主要病因，表现为心电图QT间期延长，可诱发尖端扭转型室速（Torsades de Pointes）及心源性猝死。现有标准疗法为β受体拮抗剂或植入式心律转复除颤器（ICD），均不能直接纠正离子通道的分子缺陷。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）可通过结合KCNQ1上两个已知位点（Site I位于电压感受域S4附近，引起激活电压向负移ΔV_0.5；Site II位于孔区附近，引起最大电导增加ΔG_max）激活IKs并缩短动作电位时程，但天然PUFAs缺乏亚型选择性、效价较低且存在脱靶效应，尚无临床可用的KCNQ1/KCNE1特异性激活剂。因此，研究人员拟借助计算机辅助药物设计（computer-aided drug design, CADD）开发高效、位点特异性的KCNQ1/KCNE1激活剂，以实现精准纠治LQTS相关的通道功能异常。该研究发表于《British Journal of Pharmacology》。

主要关键技术方法

研究人员采用爪蟾（Xenopus laevis）KCNQ1同源模型（PDB 5VMS，S4"上"态/孔关闭态），通过SILCS（Site Identification by Ligand Competitive Saturation，配体竞争饱和定位法）模拟生成功能基团亲和图谱（Functional group affinity maps, FragMaps），识别PUFA结合Site I与Site II并构建药效团模型（Pharmacophore models, PMs）；使用Pharmer软件对约78万化合物库进行药效团筛选，结合配体网格自由能（Ligand Grid Free Energy, LGFE）评分与K_v11.1（hERG）选择性过滤初筛候选小分子；将优选小分子单独及偶联亚油酸（linoleic acid, LIN）尾部后，通过非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）显微注射cRNA表达野生型及突变型（R228Q、K326C）KCNQ1/KCNE1，采用双电极电压钳（two-electrode voltage clamp, TEVC）记录全细胞电流，拟合Boltzmann方程获取半数激活电压V_0.5与最大电导G_max，分析ΔV_0.5与G_max/G_max0的浓度—效应关系。

研究结果

3.1 SILCS identified two known binding sites of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) in KCNQ1 (K_v7.1)

研究人员对KCNQ1进行SILCS-Hotspots分析预测到185个PUFA潜在结合位点，按LGFE排序后前5个位点中，3个位点聚类于电压感受域S4与相邻亚基S5交界处靠近精氨酸R228与R231处（即已报道的PUFA Site I，介导ΔV_0.5效应），第4个位点位于孔区S5/S6跨膜段邻近K326处（即已报道的PUFA Site II，介导G_max效应），第5个位点为邻近PIP₂结合区的低叶位点但与PUFA功能无关。SILCS成功重现已知PUFA结合位点，验证该方法适用于KCNQ1激活剂虚拟筛选，最终选定Site I与Site II进行后续筛选。

3.2 The in silico screening identified nine potential KCNQ1 activators

基于Site I药效团模型从库中筛选出36个初步匹配分子，经排除无负电荷基团及结合位偏离者，确定9个小分子（含负电头基靠近R228/R231）具较优SILCS对接评分（LGFE/RMSD ?494.0～?88.9 kcal·mol^?1·?^?1），选作实验验证对象；Site II初筛9个分子因缺负电头基、结合距K326过远且评分偏低被弃用。

3.3 Small molecules from screenings have no effect on the KCNQ1 channel

在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中，分别以100 μM浓度测试9个小分子，均未引起KCNQ1/KCNE1通道ΔV_0.5偏移或G_max改变，提示单纯小分子骨架不足以在含水相中有效锚定于跨膜结合口袋。

3.4 Addition of PUFA tail to small molecules produces strong KCNQ1/KCNE1 channel activators

研究人员将LIN的羧基末端分别与Compound 1（CHEMBRIDGE-5181715-1，含牛磺酸样负电头基及—OH）和Compound 2（CHEMBRIDGE-22152257-2，含双羧酸负电基团）可偶联部位化学连接，合成Compound 1-LIN与Compound 2-LIN。LIN尾部预期通过嵌入脂双层提高局部浓度并促进小分子头基与Site I正电残基静电互作。

3.5 Compound 1-LIN and Compound 2-LIN activate KCNQ1/KCNE1 by two different mechanisms

TEVC结果显示：Compound 1-LIN以浓度依赖性使激活曲线左移（ΔV_0.5负值增大），EC₅₀=0.75±0.08 μM，显著强于参照PUFA LIN-Tyrosine（EC₅₀=4.7±0.2 μM），且不改变G_max，提示其专一作用于Site I；Compound 2-LIN以浓度依赖性增加G_max，EC₅₀=0.014±0.007 μM，显著强于参照PUFA LIN-Taurine（EC₅₀=2.5±0.7 μM），且不引起V_0.5偏移，提示其专一作用于Site II。两化合物效价均高于既往PUFA类似物且具有位点选择性。

3.6 Mutations in Sites I and II reduce the effects of Compound 1-LIN and Compound 2-LIN

Site I关键残基突变R228Q使Compound 1-LIN引起的ΔV_0.5幅度减小（wt最大?68.3 mV vs R228Q ?37.6 mV）且EC₅₀右移（0.8 vs 3.6 μM）；Site II关键残基突变K326C使Compound 2-LIN引起的G_max增幅被消除（wt 2.1倍 vs K326C 1.06倍）。证实Compound 1-LIN主要通过Site I（R228/R231）发挥作用，Compound 2-LIN主要通过Site II（K326）发挥作用。

讨论与结论总结

研究人员指出SILCS-FragMaps可有效指导KCNQ1激活剂发现，单纯小分子虽具理论亲和力但因缺乏脂溶性尾部无法在膜环境中有效结合；将LIN尾部共价连接至具合适药效团的小分子不仅能借脂质锚定提高膜侧有效浓度，其尾部本身亦与通道跨膜区存在互作，从而稳定活性构象。所得到的Compound 1-LIN与Compound 2-LIN分别特异性激活Site I（ΔV_0.5左移）与Site II（G_max增加），效价优于已知PUFA衍生物。此"小分子头基+PUFA脂质尾"缀合策略可推广至其他具跨膜结合口袋的膜蛋白药物开发。由于LQTS不同KCNQ1突变分别导致V_0.5右移或G_max降低，两种位点特异性激活剂可据患者特定突变类型选用以个体化恢复IKs功能，为心律失常精准治疗提供依据。局限性在于未对终产物做Site I/II对接及更长时程分子动力学模拟，留待后续研究。

结论翻译：本研究表明SILCS生成的FragMaps可用于大规模小分子库筛选以鉴定KCNQ1/KCNE1（K_v7.1）激活新化合物。筛选所得小分子需在缀合PUFA脂质尾后才显现通道激活作用。Compound 1-LIN与Compound 2-LIN兼具强效与位点特异性（分别靶向Site I与Site II），优于既往PUFA类似物。将脂质尾引入具有利相互作用的小分子头部基团这一创新策略，有望推进多类膜蛋白的药物研发，尤其是靶向目前开发不足的跨膜区药物结合位点。