来自大麻不定根的细胞外囊泡样纳米颗粒对UVB诱导的人角质形成细胞损伤的保护作用

《International Journal of Cosmetic Science》：Protective effects of extracellular vesicle-like nanoparticles derived from Cannabis sativa adventitious roots against UVB-induced damage in human keratinocytes

　　

背景：植物来源的生物活性化合物在化妆品和制药行业中日益受到追捧，推动了可持续生产方法的发展。本研究探索了利用大麻（Cannabis sativa）不定根培养物生产细胞外囊泡样纳米颗粒（CA-NPs）的潜力，并研究了它们对UVB诱导的人角质形成细胞损伤的保护作用。方法：从大麻根培养物中分离CA-NPs，并表征其粒径、Zeta电位和稳定性。研究人员使用HaCaT角质形成细胞评估纳米颗粒在UVB暴露后改善细胞活力、减少凋亡和缓解氧化应激的能力。分析了皮肤屏障成分和基质金属蛋白酶（MMPs）的基因表达，并检查了潜在信号通路（MAPK, Nrf2）。结果：CA-NPs（约128 nm，-12.9 mV）表现出较强的理化稳定性，并有效保护HaCaT细胞免受UVB诱导的损伤。它们抑制MMP-1、MMP-3和MMP-9的表达，同时增强皮肤屏障相关基因（HAS1、FLG、LOR、IVL）。CA-NPs还调节MAPK和Nrf2通路，减少炎症并增强抗氧化防御。结论：大麻来源的CA-NPs为保护皮肤免受UVB诱导损伤提供了一种有前景的天然方法，支持它们作为未来护肤或药妆应用中预防光老化和炎症的生物活性候选物的潜力。

本研究针对化妆品和制药行业对植物源生物活性化合物的需求增长以及环境变化导致自然资源减少的问题，旨在探索利用大麻（Cannabis sativa）不定根培养物生产细胞外囊泡样纳米颗粒（CA-NPs），并系统评估其对紫外线B（UVB）诱导的人角质形成细胞损伤的保护作用，以开发可持续的护肤原料。研究发表于《International Journal of Cosmetic Science》。研究人员建立了大麻不定根培养体系，从根中分离纯化CA-NPs；随后以HaCaT人角质形成细胞为模型，通过UVB照射（15 mJ/cm²）模拟光损伤，系统检测CA-NPs对细胞活力、凋亡、细胞周期、DNA损伤、氧化应激、线粒体功能、基质金属蛋白酶（MMPs）及皮肤屏障相关基因表达的影响，并解析了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和核因子E2相关因子2（Nrf2）通路的作用。主要关键技术方法包括：（1）不定根诱导与培养体系建立；（2）切向流过滤（TFF）结合60%碘克沙醇超速离心法分离纯化CA-NPs；（3）动态光散射（DLS）、Zeta电位分析及直接随机光学重建显微镜（dSTORM）表征纳米颗粒理化性质与标志蛋白（BiP、HSP70）；（4）超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）鉴定代谢物组成；（5）细胞活力检测（EZ-Cytox）、流式细胞术分析（凋亡、细胞周期、活性氧ROS、线粒体膜电位和体积）、酶联免疫吸附测定（ELISA）分析MMP-1/3/9分泌、实时定量PCR（qPCR）检测基因表达、Western blot检测MAPK磷酸化和Nrf2核转位。

研究结果如下：**CA-NPs demonstrate high stability when exposed to various external stressors**：通过DLS和dSTORM证实CA-NPs粒径约128 nm、Zeta电位-12.9 mV、低多分散性（PDI=0.185），且在核酸酶、蛋白酶K、不同温度（4°C和37°C）及血清条件下保持粒径、PDI、分布和Zeta电位稳定，表明其高理化稳定性。**Identification of major metabolites from CA-NPs**：利用UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS共鉴定出27种主要代谢物，包括核苷类（腺嘌呤、鸟苷）、氨基酸类（L-苯丙氨酸、L-色氨酸）、生物碱（大麻碱）、鞘脂类（植物鞘氨醇）及糖类（葡萄糖、果糖）等，这些成分可能与抗氧化和抗炎活性相关。**CA-NP treatment enhances cell viability following UVB exposure in HaCaT cells**：CA-NPs（0.6–10 μg/mL）以浓度依赖方式提高UVB照射后HaCaT细胞活力（10 μg/mL时效果最佳），减少细胞周期中DNA碎片积累，降低γH2AX表达（指示DNA损伤），并显著减少晚期凋亡细胞比例（Annexin V/PI染色），说明其保护细胞免受UVB诱导的基因毒性和凋亡。**Protective effects of CA-NPs on UVB-induced MMP expression and skin barrier function markers in HaCaT cells**：ELISA和qPCR结果显示CA-NPs显著抑制UVB诱导的MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白和mRNA水平，上调皮肤屏障相关基因HAS1（透明质酸合成）、FLG（丝聚蛋白）、LOR（兜甲蛋白）、IVL（内披蛋白）的表达，同时下调KRT1（角蛋白1）表达，表明其可改善细胞外基质降解和异常角化，维护皮肤屏障。**Oxidative stress and mitochondrial function modulation by CA-NPs under UVB exposure in HaCaT cells**：通过CellROX Green和MitoSOX染色，CA-NPs显著降低UVB诱导的细胞总ROS和线粒体超氧化物水平；TMRM染色显示其恢复线粒体膜电位，MitoTracker染色表明减少线粒体质量代偿性增加；qPCR证实其抑制促炎细胞因子TNF、IL-6、IL-1β、IL-8的mRNA表达，揭示其抗氧化和抗炎双重作用。**CA-NPs suppress UVB-induced MAPK activation and facilitate NRF2-mediated antioxidant gene expression in HaCaT cells**：Western blot显示CA-NPs剂量依赖性地抑制UVB诱导的JNK、ERK、p38磷酸化；流式细胞术和核质分离Western blot证实CA-NPs促进Nrf2核积累并上调其下游靶基因HO-1蛋白及mRNA水平，同时上调CAT（过氧化氢酶）、GSTK1（谷胱甘肽S-转移酶K1）的mRNA表达，表明通过抑制MAPK通路和激活Nrf2/ARE通路发挥保护作用。**CA-NPs broadly suppress MAPK phosphorylation, while JNK and p38 contribute more prominently than ERK to protection against UVB-induced damage in HaCaT cells**：使用MAPK选择性抑制剂（U0126抑制ERK、SP600125抑制JNK、SB203580抑制p38），发现CA-NPs虽抑制所有三条MAPK通路，但JNK和p38抑制剂更显著地逆转UVB诱导的细胞活力下降和ROS积累，而ERK抑制作用较弱，提示JNK和p38在保护效应中贡献更大。

讨论部分总结指出，CA-NPs具有高稳定性，能够有效缓解UVB引起的氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应和皮肤屏障损伤，其机制涉及抑制MAPK（尤其是JNK和p38）通路和激活Nrf2抗氧化通路。CA-NPs中鉴定出的多种代谢物（如腺嘌呤、色氨酸、植物鞘氨醇等）可能协同参与这些保护作用。研究结论（原文翻译）为：“CA-NPs保护HaCaT细胞免受UVB诱导的细胞毒性、氧化应激、炎症反应和MAPK通路激活。这些发现支持CA-NPs作为生物活性候选物的潜力，可用于旨在缓解UVB诱导的皮肤损伤和光老化的外用或药妆制剂。”研究首次证实大麻不定根来源的纳米颗粒可作为功能性化妆品成分，为可持续的天然皮肤保护策略提供了新途径。