在Graves病中，不仅滤泡辅助性T细胞而且外周辅助性T细胞的扩增与疾病严重程度及B细胞分化相关

《International Journal of Endocrinology》：Not Only Follicular Helper T-Cells but Also Peripheral Helper T-Cells Expanded Correlate With Disease Severity and B-Cell Differentiation in Graves’ Disease

　　

目的：研究Graves病（GD）患者外周血和甲状腺中外周辅助性T（Tph）细胞的表达及其与B细胞和临床指标的相关性。方法：研究人员共招募25例新诊断的GD患者和25例健康对照（HC）。分离外周血单个核细胞。通过流式细胞术检测滤泡辅助性T（Tfh）细胞、Tph细胞和B细胞的频率及增殖活性。选取4例GD患者的甲状腺组织和4例正常甲状腺组织进行多重免疫荧光染色，观察甲状腺组织中Tfh细胞和Tph细胞的数量。结果：与健康对照相比，GD患者外周血和甲状腺组织中Tph和Tfh细胞均显著增加。两种细胞均与B细胞的增殖活性呈正相关。Tph细胞比例与血清总甲状腺素（TT4）（r=0.501）和促甲状腺激素受体抗体（TR-Ab）（r=0.472）水平相关。与TR-Ab低水平组相比，TR-Ab高水平组Tph细胞水平显著升高。Tph细胞定位于淋巴滤泡以外的区域，并可能在发炎的甲状腺中广泛促进B细胞。结论：本研究首次证明Tph细胞在GD患者外周血和甲状腺中显著扩增。与Tfh细胞类似，Tph细胞与GD严重程度和B细胞分化相关。因此，它可能成为GD免疫治疗的新靶点。

**论文解读：Graves病中外周辅助性T细胞的扩增及其与疾病严重程度和B细胞分化的关系**

**研究背景**

Graves病（Graves disease, GD）是一种以甲状腺功能亢进为主要表现的自身免疫性疾病，其病理特征为淋巴细胞浸润甲状腺组织并产生促甲状腺激素受体抗体（thyrotropin receptor antibody, TR-Ab）及炎症细胞因子。目前GD的治疗主要包括抗甲状腺药物、放射性碘和手术切除，但均存在副作用和并发症。因此，阐明GD的发病机制、寻找新的免疫治疗靶点具有重要意义。B细胞的增殖和活化在GD发病中起关键作用，而T细胞对B细胞的辅助功能是慢性免疫炎症的核心。以往研究已证实滤泡辅助性T（follicular helper T, Tfh）细胞参与B细胞分化并辅助其活化。然而，一种新发现的CD4⁺T细胞亚群——外周辅助性T（peripheral helper T, Tph）细胞，在多种自身免疫病中扩增并与疾病严重程度相关，但其在GD中的角色尚不清楚。为此，研究人员开展了此项研究，旨在探讨Tph细胞在GD患者外周血和甲状腺中的表达及其与B细胞和临床指标的相关性。

**研究概述**

Zhaowei Huang等研究人员于2024年2月至6月从上海周浦医院内分泌科和甲状腺外科招募了25例新诊断且未使用抗甲状腺药物的GD患者和25例年龄、性别匹配的健康对照（healthy controls, HC），另选取4例GD手术切除甲状腺组织和4例良性甲状腺腺瘤旁正常组织。通过多色流式细胞术检测外周血单个核细胞中Tfh（CD4⁺PD-1⁺CXCR5⁺）、Tph（CD4⁺PD-1⁺CXCR5^-）和B细胞（CD3^-CD19⁺）的频率、活化标记（CD25）及增殖标记（Ki67），并通过多重免疫荧光染色（multiplex immunofluorescence, mlF）观察甲状腺组织中Tfh和Tph细胞的分布与数量。研究得出，Tph细胞在GD患者血液和甲状腺中显著扩增，与B细胞增殖活性和疾病严重度指标（TT4、TR-Ab）正相关，且分布于淋巴滤泡外区域，提示其可能在甲状腺局部广泛辅助B细胞。该论文发表在《International Journal of Endocrinology》。

**主要技术方法**

研究人员使用了两种核心技术：①多色流式细胞术，用于检测外周血单个核细胞中Tfh、Tph和B细胞的频率、活化（CD25）及增殖（Ki67）水平；②多重免疫荧光染色（mlF），用于对甲状腺组织切片进行原位染色，以定位并计数Tfh（CD4⁺PD-1⁺CXCR5⁺）和Tph（CD4⁺PD-1⁺CXCR5^-）细胞。样本队列来源：外周血样本来自上海周浦医院内分泌科和甲状腺外科的新诊断GD患者及健康对照；甲状腺组织来自同院甲状腺外科手术切除的GD患者和良性甲状腺腺瘤旁正常组织。

**研究结果**

**3.1 外周血中Tfh和Tph细胞增加**：通过流式细胞术检测发现，与HC组相比，GD组外周血中Tfh细胞和Tph细胞的比例均显著升高（p<0.05），且具有增殖活性（Ki67⁺）的Tph细胞在GD组也显著高于HC组（p<0.05），但两组间Tfh和Tph的活化水平（CD25⁺）无显著差异。

**3.2 外周血中B细胞增殖活性增加**：两组间B细胞（CD3^-CD19⁺）比例无显著差异，但GD组中具有增殖潜能的B细胞（Ki67⁺）显著增加（p<0.05）。增殖性B细胞与Tfh（r=0.490, p<0.001）和Tph（r=0.347, p=0.014）呈正相关，且B细胞增殖程度与Tfh（r=0.420, p=0.002）和Tph（r=0.383, p=0.006）的增殖水平也呈正相关。

**3.3 Tph细胞与疾病严重程度相关**：相关性分析显示，在GD患者中，Tph细胞比例与血清总甲状腺素（TT4）水平（r=0.501, p=0.021）和TR-Ab水平（r=0.472, p=0.017）呈正相关，而B细胞增殖活性与甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）水平相关（r=0.638, p=0.001）。按TR-Ab中位数分组（高分组≥11.9 IU·L^-1，低分组<11.9 IU·L^-1），高TR-Ab组Tph细胞水平显著高于低TR-Ab组（p<0.05）。

**3.4 甲状腺中Tfh和Tph细胞增加**：多重免疫荧光染色结果显示，GD患者甲状腺组织中有大量淋巴细胞浸润和聚集，在全部4例GD样本中均检测到Tfh和Tph细胞，而对照组甲状腺仅有极少或无淋巴细胞浸润。GD组甲状腺中Tfh和Tph细胞数量均显著高于对照组（n=12，每样本3个高倍视野，p<0.001）。Tfh细胞大量集中于淋巴滤泡内部，而Tph细胞分布更广泛，存在于淋巴滤泡边缘及滤泡外区域。

**讨论与结论**

讨论部分指出，Tfh和Tph细胞在GD中共同扩增，且均与B细胞增殖活性和疾病严重程度指标相关。Tph细胞因不表达CXCR5而表达CCR2、CCR5和CX3CR1，使其定位于富含相应趋化因子的炎症组织外周，从而更广泛地辅助B细胞。研究首次证实Tph细胞在GD中扩增，并揭示其空间分布特征：Tfh集中于淋巴滤泡内，而Tph广泛分布于滤泡外区域，提示Tph可能通过辅助滤泡外B细胞（如非典型记忆性B细胞）参与GD发病。研究局限性包括单中心小样本和缺乏功能实验验证。结论部分翻译如下：总之，本研究首次发现GD患者外周血和甲状腺中Tph细胞显著增加。与Tfh细胞类似，Tph细胞与GD严重程度和B细胞分化相关。因此，Tph细胞可能是研究GD发病机制的新视角和免疫治疗的新靶点。